枸杞多糖對酒精性肝損傷小鼠腎臟的保護作用

魏芬芬，王文娟，張 波*

(北京聯合大學健康與環境學院，北京 100191)

據統計，全球每年大約有4%的死亡與酗酒有關，過量飲酒已經成為全世界的一個公共衛生問題。肝臟是酒精代謝的主要器官，但腎臟作為乙醇的排泄器官，酒精攝入后約有10%的酒精會在腎臟進行代謝。已有研究表明，腎臟中也存在乙醇代謝的關鍵酶(乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶)，因此可以推斷乙醇在腎臟中的代謝途徑可能與肝臟類似，而乙醇在腎臟代謝過程中可能也會對腎臟造成損傷[1]。

枸杞屬于茄科、枸杞屬植物，是我國一種名貴的藥食同源植物，在《神農本草》中記錄其具有滋肝補腎、益精明目等功效[2]。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)則是枸杞的主要活性成分[3]，已被證實具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、免疫調節等活性。枸杞多糖對酒精性肝損傷的保護作用已有許多研究，并且研究表明枸杞多糖可以通過增強肝臟的抗氧化作用，增強機體的應激能力，從而減輕酒精對肝臟的損害[4]。同理，既然腎臟作為乙醇最大的排泄器官，同時也負責代謝小部分乙醇，那么乙醇對腎臟是否也會產生類似肝臟的損傷作用，枸杞多糖對于腎臟的損傷是否也具有保護作用？基于以上疑問，本實驗通過建立酒精性肝損傷小鼠模型，研究枸杞多糖對小鼠酒精性腎損傷的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 枸杞多糖經水提醇沉工藝，最終獲得純度為60%的枸杞多糖，粉末狀，由中國科學院蘭州物理化學研究所提供；無水乙醇(分析純)購于北京化工廠；丙二醛(malondialdehyde，MDA；批號201709027)、還原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase，GSH；批號20171130)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號20170815)以及考馬斯亮藍(批號20170812)均購于南京建成生物工程所；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號201609)和小鼠白介素-1β(IL-1β，批號201609)酶聯免疫檢測試劑盒購于上海滬尚生物科技有限公司。德國Eppendorf公司5804R型低溫高速離心機；上海一恒科學儀器有限公司電熱恒溫培養箱；常州朗越儀器制造有限公司電動勻漿器；日本津島儀器有限公司UV-2450紫外可見分光光度計；日本日立高新技術公司7180型全自動生化分析儀；上海民橋精密科學儀器有限公司FA2104N型電子天平；日本奧林巴斯有限公司cx23生物顯微鏡。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠60只，體質量(20±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。實驗室條件：實驗動物飼養于SPF級動物房，動物使用許可證號為SYXK(京)2012-0031，溫度控制在(20±2)℃之間，空氣相對濕度50%～70%，光照設定為12 h/12 h明暗交替，自由攝食和飲水，每日更換墊料。分籠飼養，飼料充足，飲水不限，適應環境喂養3 d后用于本實驗。

1.2 方法

1.2.1 小鼠酒精性損傷模型的建立 60只昆明小鼠適應性飼喂3 d后，隨機分為5組：正常對照組、模型組、枸杞多糖低(75 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)劑量組，本劑量設置時根據藥典中，枸杞的人體推薦劑量6～12 g/d設置。第1～9天，枸杞多糖各劑量組每天經口灌胃受試物(20 mL/kg)，正常對照組和模型組則給予等體積雙蒸水。第10～16天，在灌胃受試物4 h后，枸杞多糖組和模型組小鼠均經口灌胃給予50%(V/V)濃度酒精進行造模，灌胃體積為12 mL/kg，正常對照組小鼠則給予等量雙蒸水。

1.2.2 樣品的收集與指標檢測 末次灌胃后，各組小鼠禁食不禁水16 h。稱量體質量，摘眼球取血，血漿靜置30 min后，于4 000 r/min室溫離心15 min，分離血清置于1.5 mL離心管中，4℃保存。

1.2.3 實驗動物腎臟指數的計算 解剖取得小鼠兩側腎臟后，迅速用預冷的0.9%的生理鹽水沖凈表面浮血，濾紙拭干，稱取質量，用于制備10%(V/V)腎臟組織勻漿液保存待測。按照此公式計算實驗小鼠的腎臟指數：腎臟指數/%=小鼠腎臟質量/小鼠體質量×100%。

1.2.4 血清生化指標的檢測 采用全自動生化分析儀測定血清中葡萄糖(glucose，GLU)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，CREA)的濃度。

1.2.5 腎臟組織氧化指標檢測 取10%(V/V)腎臟組織勻漿液，分別測定腎臟組織中SOD、GSH和MDA，均按照SOD、GSH、MDA測定試劑盒說明書進行實驗。

1.2.6 炎性因子檢測 取10%(V/V)腎臟組織勻漿液，用ELISA試劑盒測定腎臟組織中TNF-α和IL-1β的濃度，均按照小鼠腫瘤壞死因子-α和小鼠白細胞介素-1β試劑盒說明書進行實驗。

1.3 數據處理

采用SPSS 22軟件對實驗數據進行統計分析，結果以xˉ±s表示，顯著性檢驗采用單因素方差分析。圖片處理采用OringinPro 2017軟件。

2 結果

2.1 枸杞多糖對酒精性損傷小鼠體質量及腎臟指數的影響

為了監測酒精對小鼠體質量變化的影響，各組體質量、腎臟質量以及腎臟指數如表1所示。由表1可見，各組實驗小鼠初始體質量無明顯差異，各劑量組小鼠在灌胃枸杞多糖期間體質量也正常增長，體質量與正常對照組小鼠無明顯差異，表明枸杞多糖攝入對小鼠食欲健康等無明顯影響。從實驗第10天起，給予劑量組和模型組酒精干預，在酒精干預前，各組小鼠體質量無顯著差異。而在實驗結束時，與正常對照組相比，模型組小鼠體質量顯著降低(P＜0.01)，表明實驗小鼠在大量攝入酒精后，小鼠食欲受到影響，健康狀態欠佳，導致體質量下降。與模型組相比，枸杞多糖各劑量組體質量均升高，中劑量組則顯著升高(P＜0.05)，表明在枸杞多糖的干預下，酒精對小鼠健康的損害程度得到一定緩解。同時，與正常對照組相比，模型組小鼠腎臟指數顯著上升(P＜0.01)，表明實驗小鼠在受到酒精長期刺激后，腎臟發生腫脹，因此腎臟指數升高。與模型組相比，枸杞多糖各劑量組腎臟指數均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，表明枸杞多糖能夠緩解酒精對腎臟造成的損傷。

表1 枸杞多糖對小鼠體脂率及腎臟指數的影響

2.2 枸杞多糖對酒精性損傷小鼠血清GLU、BUN以及CREA的影響

如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠血清GLU、UREA以及CRE濃度顯均著升高(P＜0.01)，表明模型組小鼠腎臟在受到大量酒精刺激后，腎臟發生了損傷。與模型組相比，中劑量組和高劑量組小鼠血清GLU濃度顯著降低(P＜0.05)；低劑量組和高劑量組UREA濃度均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)；高劑量組CREA濃度顯著下降(P＜0.05)，表明在枸杞多糖干預下，實驗小鼠腎臟損傷得到一定緩解。

表2 枸杞多糖對小鼠血清GLU、BUN、CREA濃度的影響

2.3 枸杞多糖對酒精性損傷小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響

酒精及其代謝物會在體內引起一系列的氧化損傷，為了檢測酒精對腎臟的氧化損傷程度，我們測定了腎臟中的SOD、GSH以及MDA。由表3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠的SOD和GSH均顯著降低(P＜0.01)，MDA濃度顯著升高(P＜0.01)，表明酒精的刺激，引起腎臟發生了氧化損傷，導致SOD和GSH均下降，脂質過氧化物MDA含量上升。與模型組相比，高劑量組的SOD活力顯著升高(P＜0.01)，3個劑量組的GSH含量顯著升高(P＜0.01)，MDA含量顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，實驗結果表明，枸杞多糖對由酒精引起的氧化損傷具有一定的緩解作用，其中，對增強GSH和降低MDA含量比增強SOD活力的作用更明顯。

表3 枸杞多糖對小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響

2.4 枸杞多糖對酒精性損傷小鼠腎臟TNF-α和IL-1β的影響

TNF-α和IL-1β作為兩個重要的促炎因子，在酒精性損傷過程中被當作反映炎癥損傷程度的重要指標。由表4可知，與對照組相比，模型組小鼠腎臟TNF-α和IL-1β濃度顯著升高(P＜0.01)，表明模型組小鼠腎臟經酒精刺激后，發生了嚴重的炎癥反應。與模型組相比，各劑量組TNF-α濃度顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組的IL-1β濃度顯著降低(P＜0.05)，低劑量和中劑量降低不明顯(P＞0.05)，這表明枸杞多糖對改善炎癥反應有明顯的效果，且對TNF-α的清除能力要強于IL-1β。

3 討論

目前，飲酒過量已成為全球最嚴重的健康衛生問題之一。全球大部分國家都在努力降低酒精的使用量，以減少酒精對健康的危害。研究表明，酒精對機體的危害主要是由于酒精及其代謝產物會在體內發生一系列的氧化應激、脂質代謝紊亂及細胞凋亡等，對組織器官造成損害[5-6]。肝臟是酒精代謝的主要器官，酒精性肝損傷也一直是人們的研究熱點。但相關研究表明，腎臟也負擔著約10%的酒精代謝[7]，而腎臟中同樣存在著類似于肝臟的酒精代謝途徑即乙醇在乙醇脫氫酶的作用下，轉變成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶的作用下轉變成乙酸，最終排出體外[8]。那么在腎臟代謝乙醇的過程中，乙醇及其代謝產物同樣會對腎臟產生一定的損害。

體質量變化和臟器指數是評估機體健康狀態的一個重要指標。本實驗結果顯示，實驗小鼠在連續灌胃酒精后，與正常對照組相比，模型組小鼠體質量顯著降低，腎臟指數顯著升高，表明模型組小鼠在連續受到酒精刺激后，食欲及消化吸收功能受到影響，導致體質量下降，腎臟發生腫脹或者脂肪浸潤，導致腎臟指數上升。各劑量組與模型組相比，體質量顯著回升，腎臟指數顯著下降，表明枸杞多糖對酒精性損傷小鼠的健康有一定保護作用。血清中葡萄糖(GLU)濃度受到多種因素調節，其中腎臟對其也具有一定調節功能，主要是通過腎小管和集合管的重吸收作用發揮調節作用[9]，而血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)是臨床上評價腎功能的重要指標，當血清中GLU、BUN和CREA濃度升高時，則表明腎功能可能出現異常。在本實驗中，模型組小鼠GLU、BUN和CREA濃度顯著高于正常對照組，提示酒精可能造成了小鼠的腎功能損傷，如腎小管的重吸收能力以及腎小球濾過功能受到影響，實驗結果與王楠等[1]的研究一致，即乙醇長期刺激對小鼠腎功能的確有影響。與模型組相比，各劑量組小鼠GLU、BUN和CREA濃度均降低，表明枸杞多糖對腎功能損傷具有一定保護作用。

氧化應激是酒精性損傷的機制之一。乙醇及其代謝產物刺激機體產生的活性氧自由基會攻擊機體正常的細胞，如攻擊細胞膜內的不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化物MDA增加，并通過鏈式反應使活性氧的攻擊性更強。SOD是體內清除超氧陰離子自由基最有效的抗氧化酶，可直接將超氧陰離子自由基轉變為H2O2，達到清除自由基的目的。GSH能夠較好地清除體內多余的H2O2、LOOH等，是衡量機體抗氧化能力的重要指標之一[10]。同時，足量的GSH也能夠增強對乙醇及其代謝物的解毒能力[11]。SOD和GSH構成了機體防御自由基攻擊的重要屏障，他們通過清除超氧陰離子自由基并終止了自由基的鏈式反應，在抵抗氧化損傷中起了重要作用[12]。MDA作為脂質過氧化反應的產物，可以反映機體發生脂質過氧化反應的程度，從而間接反映機體受自由基攻擊的程度[13-14]。已有研究表明，枸杞多糖與黃芪多糖聯用可以升高GSH和降低MDA含量[14]，鐵皮楓斗多糖[15]能夠提高SOD活性，黑牛肝菌多糖[12]和香菇多糖[16]均能顯著提高SOD與GSH含量，使MDA含量顯著降低。與上述多糖類似，本實驗中，枸杞多糖能夠顯著提高SOD和GSH含量，減少脂質過氧化物MDA含量，表明枸杞多糖具有良好的抗氧化活性，能夠有效抵抗由酒精引起的機體的氧化損傷。

炎癥反應作為酒精性損傷的機制之一，也一直被人們所研究。乙醇在腎臟的代謝與排泄過程中，也會刺激腎臟發生炎癥反應。其中腫瘤壞死因子TNF-α和白細胞介素IL-1β是兩個重要的促炎因子，在炎癥反應發生過程中起著重要作用。TNF-α可以促進T細胞產生各種炎性因子，從而促使炎癥反應的發生[17]。IL-1β能夠誘導其他的炎癥細胞因子和趨化因子等的分泌，是炎癥反應中重要的促炎因子[18]。除了可以直接作用，IL-1β還通過聯合其他促炎癥因子共同發揮作用，導致機體發生“炎癥級聯效應”，加重炎癥損傷[19]。在本研究中，模型組小鼠TNF-α和IL-1β濃度顯著升高，表明由于酒精的刺激，小鼠腎臟發生了炎癥損傷。各劑量組與模型組相比，二者濃度均顯著降低，提示枸杞多糖能夠降低炎性因子濃度，減輕炎癥損傷。

綜上所述，枸杞多糖對酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護作用，其作用機制可能是通過增強機體的抗氧化能力、減少自由基的產生、減輕炎癥反應等方面發揮作用，但其具體作用機制還有待下一步研究。

(致謝：感謝中國科學院蘭州物理化學研究所提供的枸杞多糖，感謝北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室提供實驗設備)