立枯絲核菌選擇性培養基的研究

李 悅

(安康市農業科學研究所，陜西 安康 725021)

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolanikühn)的寄主范圍非常廣，據報道，在自然條件下，立枯絲核菌可以侵染200多種植物，通過人工接種的方法可以成功侵染32科的188種植物，產生多種不同的癥狀，例如腐爛、枯萎、猝倒，褐變等等[1]。立枯絲核菌作為一種嚴重危害作物的土傳病原菌，以菌絲或菌核形式在土壤中殘留越冬，在條件適宜的情況下侵染作物，引發病害，由立枯絲核菌引起的重要植物病害，如水稻紋枯病和玉米紋枯病，給農業生產帶來了重大的損失[2]。選擇性培養基是根據不同種類菌株對化學物質的敏感度不同，通過添加特定的物質來配制，用于對目的菌株進行有效篩選[3]。本研究的目的是找尋一種選擇性培養基，可抑制部分常見土壤寄生菌，但不影響立枯絲核菌的生長。利用這種選擇性培養基，可以有效的測定土壤中是否有立枯絲核菌的存在，通過生成的菌落預估土壤菌源量，從而積極采取措施，達到提前預防病害的目的。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試微生物：立枯絲核菌Rhizoctoniasolanikühn、黃曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉Aspergillusnige、木霉Trichodermasp.、根霉Rhizopussp.、鏈格孢霉Alternariaalternata、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、致病疫霉Phytophtorainfestans。

主要試劑：K2HPO4、MgSO4·7H2O 、KCl 、FeSO4·7H2O 、NaNO2、氯霉素 、醫用鏈霉素、孟加拉紅，以上所用試劑均為市售分析純。

供試農藥：98%甲霜靈原藥，山東沾化天元精細化工有限公司生產；95%咪鮮胺原藥，湖北巨勝科技有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 選擇性培養基篩選 參考已有報道配方制作基礎培養基[4～5]，配方如下：K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 10 mg；NaNO20.2 g；氯霉素0.05 g；瓊脂20 g；蒸餾水1 000 mL。制備完成后在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min，在培養基冷卻到50～55℃時加入0.1 g·L-1鏈霉素和0.035 g·L-1孟加拉紅，然后分別加入以下三種混配藥劑，①0.06 g·L-1甲霜靈，0.005 g·L-1咪鮮胺；②0.08 g·L-1甲霜靈，0.007 g·L-1咪鮮胺；③0.1 g·L-1甲霜靈，0.01 g·L-1咪鮮胺。

分別在培養黃曲霉、黑曲霉、木霉、根霉、鏈格孢霉、尖孢鐮刀菌、致病疫霉和立枯絲核菌等土壤中常見病原菌的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，分別移至各配方培養基平板中央，重復3次，28℃培養，以加入等量無菌水的基礎培養基為對照，3 d后測量各菌塊在培養基上的菌落直徑，篩選出最適合立枯絲核菌的選擇性培養基配方。

1.2.2 選擇性培養基效果驗證 將立枯絲核菌菌株接種于麥麩培養基中(50 g麥麩+50 g水的麥麩培養基中放入5塊直徑5 mm的菌絲塊)，28℃培養14 d，每日搖動培養基若干次，備用。分別將帶菌麥麩與大田土壤按照5 ∶ 5，3 ∶ 7，1 ∶ 9的體積比混勻，制成含菌量不同的帶菌土，混勻后置于25℃的恒溫烘箱中24 h，風干后研磨，稱取0.1 g均勻地撒在已制備好的選擇性培養基平板上，置于28℃培養24 h, 通過鏡檢確定長出的菌落是立枯絲核菌后統計菌落數。每處理測定5皿，重復3次，以無菌土作為對照。

2 結果與分析

2.1 選擇性培養基篩選結果

選擇性培養基的篩選試驗結果如表1所示，配方1對根霉以及致病疫霉的抑制效果不理想，配方2和3均可有效抑制除立枯絲核菌以外的其它病菌的生長，但是與對照處理比較，加入藥劑后的培養基對 立枯絲核菌的生長也有一定的抑制作用，配方3由于加入的藥劑濃度更高，對立枯絲核菌的抑制作用更強，因此選擇使用配方2作為立枯絲核菌的選擇性培養基(表1 )。

2.2 選擇性培養基效果驗證

將培養皿置于28℃恒溫箱中培養24 h后觀察有白色菌落生成， 通過鏡檢確定長出的菌落全部是立枯絲核菌，未見其他微生物菌落。經菌落數統計，各處理土壤含菌量差異顯著，各處理中加入菌源量是5 ∶ 3 ∶ 1，經選擇性培養基篩選后，統計土壤菌量結果是5.70 ∶ 3.37 ∶ 1，結果近似初始加入菌源量(表2)。

表1 不同植物病原菌在3種選擇性培養基上的生長情況

表2 各處理土壤中立枯絲核菌含量

3 結論與討論

通過試驗驗證，配方2對除立枯絲核菌以外的其他常見土壤寄生菌有較強的抑制作用，可以作為立枯絲核菌的一種選擇性培養基，利用其特殊作用將立枯絲核菌從土壤中鑒別出來。用篩選的選擇性培養基測定混有不同比例帶菌土中立枯絲核菌的含量，從最終結果來看，該培養基可以較為準確的測得土壤中立枯絲核菌的含量，所以在實際生產過程中，這種選擇性培養基可以有效用于測定土壤中是否有立枯絲核菌的存在，通過生成的菌落預估土壤菌源量，從而積極采取預防措施，達到控制病害發生的目的。

立枯絲核菌有多個菌絲融合群，來自不同融合群的菌株之間存在一定差異，本次試驗只選用了一株菌株，后期還需利用來自不同菌絲融合群的菌株進行效果驗證。另外土壤中寄生菌復雜多樣，本試驗只選取了常見的幾種，選擇性培養基在實際應用過程中還可不斷完善優化，確保其選擇的有效性。