響應面法制備小球藻多肽-鈣螯合物的制備工藝

花朋朋，熊 煜，于志穎，劉 斌，，趙立娜

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002）

小球藻（Chlorella pacifica）是一種單細胞綠藻，屬于綠藻門 （Chlorophyra）、綠藻綱 （Chlorophyceae）、小球藻屬（Chlorella），具有生長繁殖迅速等特點。小球藻富蛋白質(zhì)[1]，營養(yǎng)價值高，易于被人體吸收，包含8種人體必需氨基酸，完全能滿足人、動物的生長所需，具有很高的應用價值[2-4]。目前，國內(nèi)外的研究熱點是藻類蛋白活性肽，大部分研究主要集中在開發(fā)藻類多肽的抗氧化、抗菌、降壓、降脂、預防骨質(zhì)疏松等生物活性免疫調(diào)節(jié)等功能性生物活性肽[5]，然而對小球藻鈣螯合肽活性的研究卻不常見。

鈣在人體機能中扮演著重要功能作用，當機體攝入鈣不足會造成佝僂病、軟骨病、骨質(zhì)疏松等各種疾病，同時會對人類的生命健康造成重大的危害[6。目前市場上鈣補充制劑很多，主要有無機鈣、有機鈣[7]。然而，眾多補鈣產(chǎn)品的生產(chǎn)及銷售并未能從根本上改變?nèi)藗兊娜扁}問題，其原因在于一方面人體對鈣的攝入不夠，另外一方面就是人體機能內(nèi)部對鈣的有效吸收率低[8]，隨之而來又有一個弊端，雖然一些有機鈣制劑能夠可以大量被機體吸收，但會伴隨負反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)失調(diào)，反而抑制鈣的吸收。目前，已發(fā)現(xiàn)多肽具有礦質(zhì)載體的作用，可與金屬離子螯合形成多肽-鈣復合物，進而促進小腸對鈣的吸收，如牛乳酪蛋白磷酸肽[9]、蛋黃肽、大豆蛋白肽、魚鱗及魚骨肽[10-18]。但這些多肽制備價格昂貴，因此小球藻多肽螯合鈣以其生物效價高、易吸收、無毒、無刺激作用等優(yōu)點[19]成為了為第4代補鈣制劑，得到了人們的青睞。

試驗以小球藻為原料，通過中性蛋白酶酶解法，來制備小球藻多肽，并將其與Ca2+進行螯合，目的在研發(fā)具有螯合率較高的小球藻多肽-鈣螯合物。利用單因素試驗探究了螯合時間、螯合溫度、螯合肽鈣質(zhì)量比、螯合底物質(zhì)量分數(shù)和pH值對螯合率的影響。并通過響應面試驗優(yōu)化制備工藝，制得了較高品質(zhì)的小球藻多肽-鈣螯合物。該研究可充分發(fā)揮多肽和礦物質(zhì)元素對人體的雙重營養(yǎng)功能特性，為小球藻應用開發(fā)提供了一種新的開拓思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻，臺灣綠藻工業(yè)股份有限公司提供；中性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供；EDTA、氫氧化鉀（KOH）、三乙醇胺、鈣指示劑、CaCl2、鈣羧酸指示劑、無水乙醇和氫氧化鈉（NaOH）等，均為分析純；去離子水，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

TDL-5-A型低速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司產(chǎn)品；FE20型精密pH計、ZD-2型雷磁電位自動滴定儀，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；FD-3型冷凍干燥機，河北國輝實驗儀器有限公司產(chǎn)品；電子分析天平，上?；茖嶒炂鞑挠邢薰井a(chǎn)品；SHA.B型精達水浴恒溫振蕩器，常州精達儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 小球藻多肽的制備流程[20]

小球藻→去離子水溶解（料液比1∶30）→添加NaOH（溶液質(zhì)量分數(shù)為4%）→在50℃下水浴1 h→6層紗布過濾→離心（5 000 r/min，10 min） →取上清液→調(diào)pH值3（30 min） →離心（5 000 r/min，10 min）→沉淀冷凍干燥→小球藻蛋白→去離子水溶解（料液比1∶30）→調(diào)整pH值7.5→中性蛋白酶酶解（40℃）→40℃水浴6 h→沸水浴滅酶（10 min）→離心（4 500 r/min，10 min） →上清液（小球藻多肽溶液）→冷凍干燥→小球藻多肽。

1.3.2 小球藻多肽-鈣螯合物的制備

稱取一定量小球藻多肽復溶成一定濃度的多肽溶液，加入1 mol/L NaOH調(diào)整pH值為9.0，按一定質(zhì)量比加入鈣離子（以無水氯化鈣的形式），將其放置于一定溫度的水浴搖床中充分反應一段時間，反應后置于室溫冷卻，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min取上清液，加入5倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min取沉淀，用無水乙醇對沉淀物洗滌數(shù)次，將其置于烘箱中進行低溫干燥處理，使無水乙醇揮發(fā)，然后進行凍干獲得多肽-鈣螯合物粉末。

1.3.3 測定總鈣含量的測定[21]

反應液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），依此將2~3 mL三乙醇胺、0.8~1.0 mL氫氧化鉀溶液、適量鈣指示劑加入，搖勻，接著用EDTA溶液滴定，溶液從紫紅色變成純藍色為終點，記錄EDTA體積V0。根據(jù)公式計算可得總鈣含量M0。

1.3.4 螯合鈣含量的測定

反應液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），量筒量入20 mL的乙醇，恒溫條件下振搖1 h，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，去除上清液，蒸餾水定容20 mL，吸取2 mL此溶液，同1.3.3步驟（EDTA滴定），記錄EDTA體積V1。根據(jù)公式計算可得螯合鈣含量 M1。

1.3.5 鈣螯合率的測定

式中：M0——反應液中總鈣含量，g；

M1——表示同體積反應液中螯合鈣的鈣含量，g。

1.3.6 螯合條件單因素試驗

（1）螯合時間對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分數(shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比1∶2水浴搖床溫度設置40℃，螯合時間分別為 20，30，40，50，60，70，80 min，測 3 次螯合率。

（2）螯合溫度對鈣螯合率的影響。取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分數(shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比1∶2，水浴搖床溫度分別設置30，40，50，60，70，80℃，螯合時間50 min，測3次螯合率.

（3）肽鈣質(zhì)量比對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分數(shù)3%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比分別為 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

（4）底物質(zhì)量分數(shù)對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分數(shù)2%，3%，4%，5%，6%，7%，調(diào)整pH值為8，肽鈣質(zhì)量比3∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

（5）pH值對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質(zhì)量分數(shù)3%，調(diào)整pH值分別為5，6，7，8，9，10，11，12，肽鈣質(zhì)量比3∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

1.3.7 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以鈣螯合率為指標，選取4個對鈣螯合率影響最顯著的因素（螯合溫度、肽鈣質(zhì)量比、底物質(zhì)量分數(shù)、pH值），采用Box-Behnken組合方法進行四因素三水平響應面試驗設計，同時運用Design Expert 8.1軟件設計試驗對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 螯合時間對鈣螯合率的影響

螯合時間對鈣螯合率的影響見圖1。

圖1 螯合時間對鈣螯合率的影響

由圖1可知，鈣螯合時間在20~50 min時，鈣螯合率隨螯合時間的延長而升高；當螯合時間在50 min時，鈣螯合率最高，達到79%±0.02%；但是，當螯合時間大于50 min時，鈣螯合率開始下降。此現(xiàn)象說明螯合時間過長，很容易造成鈣螯合物結構的不穩(wěn)定，反而不利于鈣螯合物的發(fā)生[22-23]。此結果表明螯合時間對鈣螯合率沒有顯著性差異，說明鈣螯合反應迅速，螯合時間對螯合率的影響較小[24]。所以在后續(xù)的螯合試驗中，選擇螯合時間為50 min。

2.1.2 螯合溫度對鈣螯合率的影響

螯合溫度對鈣螯合率的影響見圖2。

圖2 螯合溫度對鈣螯合率的影響

由圖2可知，鈣螯合溫度在30~60℃時，鈣螯合率快速增加；在60℃時，鈣螯合率最高，達到85%±0.01%；當螯合溫度大于60℃時，鈣螯合率開始下降，原因在于一方面溫度過高會使氨基酸或者小肽發(fā)生羰氨反應，與鈣離子形成競爭，導致鈣螯合率降低，另一方面溫度過低會使螯合反應速率變慢[25-27]。因此螯合溫度定位60℃，進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 肽鈣質(zhì)量比對鈣螯合率的影響

多肽與氯化鈣質(zhì)量比對鈣螯合率的影響見圖3。

圖3 多肽與氯化鈣質(zhì)量比對螯合率的影響

由圖3所示，當小球藻多肽與鈣質(zhì)量比為3∶1時，鈣螯合率最大為87%±0.02%，繼續(xù)增大氯化鈣質(zhì)量，鈣螯合率開始下降；當氯化鈣的添加量較小，多肽過量時，使得部分多肽無法與鈣離子形成穩(wěn)定結構，造成了活性多肽的浪費，當Ca2+含量過高時，多肽中的鈣螯合位點達到飽和狀態(tài)，導致大多數(shù)鈣以游離態(tài)的形式出現(xiàn)在反應體系中，最終導致鈣螯合率的較低[28]。最終選擇肽鈣質(zhì)量比為3∶1，進行后續(xù)響應面的優(yōu)化。

2.1.4 底物質(zhì)量分數(shù)對鈣螯合率的影響

底物質(zhì)量分數(shù)對鈣螯合率的影響見圖4。

圖4 底物質(zhì)量分數(shù)對鈣螯合率的影響

由圖4可知，在底物質(zhì)量分數(shù)為5%時，鈣螯合率最大為90%±0.01%，再增加多肽質(zhì)量濃度鈣螯合率反而下降。這可能是因為當多肽濃度較大時，會造成反應體系的黏度系數(shù)，減小了二者的接觸面積和幾率，不利于螯合反應的進行，降低了鈣螯合率。最終，選擇底物質(zhì)量分數(shù)5%進行后續(xù)響應面試驗。

2.1.5 pH值對鈣螯合率的影響

pH值對鈣螯合率的影響見圖5。

圖5 pH值對鈣螯合率的影響

由圖5可知，當螯合液在酸性條件下時，鈣螯合率較低。這可能是由于H+與Ca2+二者發(fā)生對供電子基團的競爭[29]，對小球藻多肽-鈣螯合物的生成造成了阻礙。當螯合液pH值在5.0~9.0時，隨著pH值的不斷升高，鈣螯合能力快速升高，在pH值9.0時，鈣螯合率最大為96%±0.01%；但pH值超過9.0時，鈣含量反而下降，此時可能因為在強堿條件下容易發(fā)生了一系列的副反應，導致鈣螯合率較低[30]。因此選擇pH值為9.0，進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.2 螯合條件響應面試驗結果

2.2.1 數(shù)學模型的建立及顯著性檢驗

響應面試驗設計和結果見表1。

表1 響應面試驗設計和結果

如表1所示，以鈣螯合率作為響應值，運用Design Expert回歸分析軟件分析表1中29個試驗點的響應值，綜合數(shù)據(jù)分析，各試驗單因素對鈣螯合率的影響，得出如下回歸方程：

響應面二次模型方差分析見表2。

表2 響應面二次模型方差分析

其回歸方程達到了極顯著水平（p<0.01），且失擬項不顯著（p>0.05），表明此建模成功。總決定系數(shù)R2=0.945 3，表明該方程是高度顯著的，即該模型預測值與實際試驗值擬合較好。由表2可知，D，AD，CD，BC，B2，C2，D2項都對鈣螯合率有顯著的影響，順序為pH值>肽鈣質(zhì)量比>底物質(zhì)量分數(shù)>螯合溫度。從響應面分析圖可以直觀地看到2個因素間的交互作用對鈣螯合率的影響大小，螯合溫度、肽鈣質(zhì)量比、底物質(zhì)量分數(shù)、pH值4個因素之間交互作用對鈣螯合率的影響。

如表2和圖6所示，對鈣螯合率影響最顯著的交互作用是底物質(zhì)量分數(shù)和pH值，其次是螯合溫度和pH值，而肽鈣質(zhì)量比和pH值之間的交互作用，對響應值沒有顯著差異。

2.2.2 響應面試驗分析及對小球藻多肽鈣-螯合物制備的優(yōu)化

通過Design Expert軟件綜合分析得出的回歸方程，讓各因素保持不變，只對回歸模型進行適宜的緯度調(diào)整，從而考查各因素間的交互作用對小球藻多肽-鈣螯合物鈣螯合率的影響。通過對回歸分析結果進行分析，作出響應面和等高線圖。

如圖6所示，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明二者交互作用顯著，同時相應面圖出現(xiàn)最高點，鈣螯合率值最大[31]。試驗表明，底物質(zhì)量分數(shù)和pH值之間、pH值和螯合時間之間存在著較顯著的交互作用。

交互作用對鈣螯合率影響的響應面圖見圖6。

圖6 交互作用對鈣螯合率影響的響應面圖

利用Design Expert軟件由所建的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出小球藻多肽-鈣螯合物的鈣螯合率最高參數(shù)條件為螯合溫度54.05℃，肽鈣質(zhì)量比3.13，底物質(zhì)量分數(shù)4.75%，pH值9.02，螯合時間50 min，鈣含量的預測值為96.14%，為適合操作，調(diào)整條件螯合溫度75℃，pH值9，肽鈣質(zhì)量比2∶1，底物質(zhì)量分數(shù)5%，螯合時間60 min，做3組平行試驗。對試驗進行驗證，得結果表明在此條件下螯合率為97.15%±0.001 225%，與預測值無顯著性差異（p>0.05）。證明此條件為小球藻多肽鈣螯合反應的最優(yōu)條件，該回歸方程可應用于實踐。

3 結論

由響應面分析法優(yōu)化小球藻多肽與鈣螯合的最佳工藝條件為螯合溫度50℃，pH值9，肽鈣質(zhì)量比3∶1，底物質(zhì)量分數(shù)5%，螯合時間60 min，在此條件下制備的螯合物的鈣螯合率為97.15%±0.001 225%，與預測值96.14%沒有顯著性差異。小球藻多肽和鈣離子發(fā)生螯合反應，生成了一種新型多肽-鈣螯合物，為合成新型補鈣制劑的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)，同時也為小球藻的開發(fā)利用提供了一個新的研究思路。