microRNA-31通過靶向調控Dock1抑制乳腺癌的上皮-間質轉化①

曾國棟 陳智凱 林祥博 尹崇高 李洪利

(山東省濰坊醫學院生物科學與技術學院，濰坊261053)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年的發病率逐年上升，嚴重危害全球女性生命健康[1]。原位乳腺癌并不致命，90%以上患者死亡的主要原因是癌細胞的侵襲與轉移[2]。近年來，臨床上對于乳腺癌的治療已有很大的進展，但乳腺癌的發病率及死亡率仍呈現不斷上升的趨勢[3]。因此，研究乳腺癌侵襲與轉移相關的分子機制可以為治療乳腺癌提供新的依據。microRNA(miRNA)是一種內源性非編碼單鏈RNA，長度約為22 個核苷酸[4,5]。它不編碼蛋白質，卻可以通過與目標 mRNA 的互補結合，下調靶基因的表達或翻譯，從而調控細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移等行為[6,7]。研究發現miR-31在多種惡性腫瘤的侵襲轉移中起重要作用，包括肝癌、肺癌、胃癌、神經性膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌等，且多數腫瘤的侵襲和轉移與上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關[8-13]。本課題組前期研究發現miR-31可以靶向調控Dock1，通過此機制抑制神經性膠質瘤的侵襲轉移[14]，但是其能否在乳腺癌中起相同作用尚未見報道，因此本文通過對乳腺癌中miR-31及Dock1的研究，為乳腺癌的臨床治療及預防其侵襲和轉移提供新的靶點和途徑。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、RPMI1640購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000 轉染試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒Prime Script?RT reagent Kit和SYBR?Prime Script?miRNA RT-PCR Kit 購自大連TaKaRa公司，Transwell小室購于Corning公司，Matrigel購于BD公司，抗體試劑均購于Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人正常上皮乳腺細胞MCF-10A培養于含血清、氫化可的松(Hydrocortisone)、霍亂毒素(Cholera toxin)、胰島素(Insulin)、表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12培養基中，乳腺癌細胞MDA-MB-231培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，MCF-7細胞使用MEM培養基加10%胎牛血清培養。所有細胞均置于37℃、5%CO2的環境中培養。

1.2.2逆轉錄及熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR) 莖環法 逆轉錄及qRT-PCR具體實驗步驟見本課題組先前實驗結果[15]。 PCR條件為95℃ 5 s、63℃ 30 s、72℃ 30 s進行35個循環，采用 U6作為內參。 miR-31上游引物：GCGAGGCAAGATGCTGGC，下游引物：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，莖環序列：GTCGTATCCAGTGCAG-GGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTAT。

1.2.3Western blot 實驗過程見本課題組先前實驗過程[16]，所用抗體濃度如下：β-actin(1∶1 000)、Dock1(1∶1 000)、E-cadherin(1∶500)、Vimentin(1∶1 000)。 β-actin作為內參。

1.2.4Transwell侵襲實驗 將轉染后的150 μl(4×105cells/ml)細胞懸液添加到Transwell小室上層中，下層加入20%胎牛血清的培養基500 μl，置于細胞培養箱中培養，24 h后4%多聚甲醛固定20 min，使用Giemsa染色35 min，PBS清洗3次，于顯微鏡下隨機選取10個視野拍照計數，取平均值為實驗的最終結果。所有實驗均重復3次。

2 結果

2.1miR-31及Dock1在人正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞中的表達情況 qRT-PCR、Western blot分別檢測人正常乳腺上皮細胞MCF-10A、乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7中miR-31、Dock1的表達情況。結果顯示，miR-31在MCF-7細胞中的表達水平高于MDA-MB-231細胞，但都明顯低于正常肺上皮細胞MCF-10A細胞中的表達水平；MDA-MB-231細胞中Dock1的表達水平高于MCF-7細胞，Dock1在MCF-10A細胞中表達水平最低(見圖1)。結果提示，miR-31在乳腺癌中為抑癌基因，Dock1為癌基因。

圖1 miR-31及Dock1在人正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-31 and Dock1 in human normal mammary epithelial cells and breast cancer cellsNote: A.Expression level of miR-31 in the cells of each group ;B.Expression level of Dock1 in the cells of each group;C.Gray value of B diagram;*.P<0.05.

圖2 MDA-MB-231細胞miR-31及Dock1的轉染效率Fig.2 Transfection efficiency of miR-31 and Dock1 in MDA-MB-231 cellsNote: A.Transfection efficiency of miR-31 in MDA-MB-231 cells;B.Transfection efficiency of Dock1 in MDA-MB-231 cells;C.Gray value of B diagram;*.P<0.05.

2.2轉染后miR-31和Dock1在各組乳腺癌細胞中的表達情況 qRT-PCR、Western blot檢測轉染不同質粒后各組乳腺癌細胞中miR-31、Dock1的表達情況，結果顯示，MDA-MB-231細胞在轉染對照質粒后miR-31的表達水平與正常組相比無明顯差距，但在轉染過表達質粒后miR-31的表達水平明顯升高。Western blot檢測轉染后各組乳腺癌細胞中Dock1的表達情況，MDA-MB-231對照組與正常組比較Dock1表達水平幾乎無差距，轉染敲除質粒后Dock1的表達水平明顯下調(見圖2)。結果提示轉染成功。

2.3轉染后各組乳腺癌細胞中Dock1蛋白的表達變化 為了檢測轉染過后各組細胞中Dock1蛋白的表達變化情況而采用Western blot實驗。結果顯示MDA-MB-231/miR-31細胞相比于MDA-MB-231/NC細胞中Dock1的表達水平明顯下調(見圖3)，結果提示，miR-31可以負向調控Dock1蛋白的表達。

圖3 轉染后各組乳腺癌細胞中Dock1蛋白的表達變化Fig.3 Expression of Dock1 protein in breast cancer cells after transfectionNote: A.Expression of Dock1 protein in breast cancer cells after transfection;B.Gray value of A diagram;*.P<0.05.

圖4 miR-31靶向調控Dock1對乳腺癌細胞侵襲轉移的影響Fig.4 Effect of miR-31 targeting Dock1 on invasion and metastasis of breast cancer cellsNote: A.Changes in cell invasion and metastasis of cells in each group;B.Counting the cells of each cell group in the A diagram;*.P<0.05.

圖5 miR-31靶向調控Dock1對乳腺癌EMT的影響Fig.5 Effect of miR-31 targeting Dock1 on EMT in breast cancerNote: A.Changes of EMT markers in the each group cells;B.Gray value of A diagram;*.P<0.05.

2.4miR-31靶向調控Dock1對乳腺癌細胞侵襲轉移的影響 為了驗證miR-31靶向調控Dock1在乳腺癌中的具體作用，利用Transwell侵襲實驗檢測miR-31對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。結果顯示MDA-MB-231/miR-31組相比于MDA-MB-231/NC組穿過基底膜的細胞數明顯減少，而與MDA-MB-231/miR-31+con組相比無明顯差距；MDA-MB-231/miR-31+Dock1組與MDA-MB-231/miR-31+con組相比穿過基底膜的細胞數明顯增多(見圖4)，差異具有統計學意義。結果提示，miR-31可以通過調控Dock1表達來抑制乳腺癌的侵襲轉移。

2.5miR-31靶向調控Dock1對乳腺癌EMT的影響 用Western blot檢測EMT標志分子的表達變化來驗證miR-31和Dock1與乳腺癌EMT的聯系。結果顯示，MDA-MB-231/NC細胞與MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vimentin表達水平相比無明顯變化，MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con細胞相比于MDA-MB-231/NC細胞中E-cadherin表達水平顯著上調，在MDA-MB-231/miR-31+Dock1細胞中E-cadherin的表達水平與對照組相比無統計學意義；與MDA-MB-231/NC細胞相比，MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con細胞中Vimentin表達水平明顯下調，MDA-MB-231/miR-31+Dock1細胞中Vimentin的表達水平幾乎無變化(見圖5)。結果提示，miR-31通過靶向調控Dock1蛋白的表達，進而調節乳腺癌EMT的發生。

3 討論

乳腺癌細胞常在特定生理或病理狀態下發生EMT，即喪失正常上皮細胞的特性，獲得間質細胞的形態及遷移運動能力[17]，黏附性降低的癌細胞可以浸潤轉移至其他組織或隨血液播散至全身，形成轉移，危及生命。EMT的標志物有很多，如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等，E-cadherin是上皮組織中的一類依賴Ca2+的細胞間黏附分子，可以維持細胞間黏附性和極性，Vimentin是間質細胞標志分子，E-cadherin表達下調、Vimentin的表達異常上調是EMT發生的重要特征[18]。 眾多研究發現miR-31可協調抑制多種靶基因，從而調控惡性腫瘤的侵襲轉移及EMT的發生[19]。Gao等[20]研究發現miR-31通過負向調控LATS2可以調節食管癌的EMT；Cottonham等[21]發現，miR-31通過聚集TIAM1來調節結腸癌侵襲和轉移。本實驗結果顯示miR-31在乳腺癌細胞中表達相對較低，改變乳腺癌細胞中miR-31的表達會影響乳腺癌的侵襲能力及EMT的發生。本課題組前期研究發現miR-31通過靶向調控Dock1對膠質瘤EMT的發生起抑制作用，提示miR-31可能通過調控Dock1來發揮作用。

Dock1(Dedicator of cytokinesis 1)屬于Dock 家族蛋白之一，亦是整合素信號通路的重要組分[22]。Wang等[23]發現Dock1的蛋白結構域DHR2 (Dock homology regions 2)與Crk蛋白結合，可激活Rac1并發揮促進細胞遷移等作用。此外，Dock1還在乳腺癌、肺癌等諸多惡性腫瘤中發揮重要作用[24,25]，本研究采用Western blot檢測轉染后的乳腺癌細胞中Dock1表達水平的變化，證實miR-31參與調節Dock1的表達。

綜上所述，本研究證實miR-31可以調控Dock1的表達來抑制乳腺癌細胞EMT的發生，進而抑制乳腺癌的侵襲與轉移，這一發現將為乳腺癌的治療提供新的思路與途徑。但miR-31是否會結合其他靶基因共同調控乳腺癌的侵襲與轉移目前尚不清楚，需要我們進行更加深入的研究。