NLRP2-caspase-1炎性小體在腦缺血損傷中的表達量及作用

劉金泉 紀 寧 劉金濤

(大同大學神經病學與精神病學教研室,大同037009)

星形膠質細胞是一種含量最多的中樞神經細胞，可通過分泌細胞因子、神經營養因子等，從而對神經細胞起保護、支持的作用，在中樞神經系統內起著關鍵的作用。大量研究表明，星形膠質細胞對腦功能發揮重要作用，尤其是在腦缺血損傷中[1-4]。腦缺血缺氧的損傷程度可導致星形膠質細胞功能的改變[5]。腦缺血損傷初期，星形膠質細胞可降低腦內對神經元有害物質的含量如自由基、興奮性氨基酸等，從而發揮保護作用；當腦缺血損傷嚴重時，星形膠質細胞發生大量的凋亡，導致神經元進一步發生損傷。因此，在腦缺血損傷的相關研究中，降低星形膠質細胞凋亡具有重要意義。近年來的研究表明，炎癥反應對腦缺血損傷的發生、發展具有密切相關性[6,7]。NOD樣家族受體(NOD-like receptors,NLRS)在機體的炎癥反應中起重要作用。最近的研究表明，星形膠質細胞體外培養過程中可分泌NOD樣受體家族蛋白2(NOD-like receptor protein 2,NLRP2)炎癥小體[8]。目前，關于NLRP2的相關研究較少，尤其是在腦缺血損傷中，因此本實驗檢測星形膠質細胞中NLRP2水平及采用小RNA干擾(siRNA)技術沉默NLRP2的表達，觀察其在腦缺血損傷中的作用并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6J小鼠購買于北京維通利華實驗動物中心；DMEM培養基、胰酶、胎牛血清、Trizol、siRNA、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液、膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；鼠抗β肌動蛋白(β-actin)抗體、兔抗NLRP2抗體、兔抗白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β )抗體、兔抗核轉錄因子κB(Nuclear factor-Kappa B,NF-κB)p65抗體購自美國Proteintech公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)抗體、caspase-1前體(Pro-caspase-1)抗體、兔抗磷酸化p65(p-p65)抗體、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體購自武漢博士德公司；RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國Beckman coulter公司；細胞培養箱購自日本Heraeus公司；凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.2方法

1.2.1星形膠質細胞的培養以及氧糖剝奪模型的構建 處死小鼠，取出大腦，去除小腦、腦膜、血管，收集大腦皮層組織，根據文獻[9]所示方法進行純化。收集1×106個/ml細胞接種于培養瓶培養、傳代。選取對數期星形膠質細胞，以每孔4×104個接種于96孔板中，根據文獻[10]，將細胞置于無氧、無糖環境中培養6 h，造成氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)損傷后，轉移至37℃、5%CO2細胞培養箱中，常規氧氣供給，繼續培養24 h。

1.2.2熒光定量PCR(RT-PCR)檢測細胞中NLRP2 mRNA的表達量 收集細胞，吸取適量Trizol冰上裂解5min，提取細胞中總RNA。吸取1 μg RNA根據反轉錄試劑盒說明書，合成為cDNA，在RT-PCR試劑盒說明書的指示下，進行定量PCR，結果采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3免疫印跡試驗(Western blot)檢測細胞中NLRP2 蛋白的表達量 棄去細胞培養板中溶液，加入0.25%胰酶消化細胞，離心，按1∶4的比例加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，BCA法測定蛋白樣品的濃度。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，轉移至PVDF膜中；5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別加入一抗、二抗，顯色、曝光，凝膠成像儀中觀察圖像，Quantity One分析蛋白質灰度值。

1.2.4細胞的轉染 實驗前，選取抑制效果較強的siRNA NLRP2；將星形膠質細胞分為4組，對照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組。根據1.2.1所示實驗方法，選取氧糖剝奪后繼續培養24 h的細胞，以每孔3×105個加入6孔板中，培養24 h進行轉染。根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書，將攜帶無義序列和NLRP2序列的siRNA分別轉染入氧糖剝奪細胞中。RT-PCR和Western blot檢測轉染后NLRP2的表達量。

1.2.5細胞凋亡的檢測 根據Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書的指示，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，避光，避光15 min，流式儀檢測細胞的凋亡率。

1.2.6細胞凋亡蛋白及炎性因子的檢測 根據1.2.3所示，采用Western blot檢測細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3及Pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白水平。

2 結果

2.1OGD損傷的星形膠質細胞中NLRP2的表達量 如圖1所示，以常規培養的星形膠質細胞為對照組，對照組和OGD模型組星形膠質細胞中NLRP2 mRNA的表達量分別為1.000±0.009、2.698±0.315；NLRP2蛋白水平分別為0.352±0.036、0.784±0.071。與對照組相比，OGD模型組星形膠質細胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平上調，差異具有顯著統計學意義(P<0.05)。

2.2轉染siRNA NLRP2對OGD損傷星形膠質細胞中NLRP2表達量的影響 如圖2所示，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質細胞中NLRP2 mRNA的表達量分別為1.002±0.007、0.993±0.008、0.421±0.038；NLRP2蛋白水平分別為0.348±0.035、0.363±0.041、0.124±0.013。與模型組相比，空載體組細胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平差異無統計學意義，siRNA NLRP2組星形膠質細胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平顯著下調，具有統計學意義(P<0.05)。

2.3沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞凋亡的影響 如圖3所示，對照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質細胞凋亡率分別為(5.693±0.674)%、(32.682±3.415)%、(35.487±3.662)%、(18.674±2.453)%。與對照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組細胞的凋亡率增加，差異具有顯著統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，空載體組細胞凋亡率差異無顯著統計學意義，siRNA NLRP2組星形膠質細胞凋亡率顯著降低，具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 OGD損傷的星形膠質細胞中NLRP2的表達量Fig.1 Expression of NLRP2 in astrocytes with OGD Note: 1.Control group;2.OGD model group.Compared with the control group,*.P<0.05.

圖2 轉染后對OGD損傷的星形膠質細胞中NLRP2的表達量的影響Fig.2 Effect of transfection on NLRP2 expression in astrocytes with OGD Note: 1.Model group;2.Empty vector group;3.siRNA NLRP2 group.Compared to model group,#.P<0.05.

2.4沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞凋亡蛋白的影響 如圖4所示，對照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質細胞中Bcl-2蛋白水平分別為0.652±0.068、0.215±0.023、0.234±0.020、0.539±0.056，Bax蛋白水平分別為0.362±0.041、0.832±0.085、0.814±0.082、0.421±0.038，caspase-3蛋白水平分別為0.257±0.024、0.685±0.063、0.692±0.065、0.365±0.032。與對照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組Bcl-2蛋白降低(P<0.05)，Bax蛋白(P<0.05)、caspase-3蛋白增加(P<0.05)，差異具有顯著統計學意義；與模型組相比，空載體組Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白差異無顯著統計學意義，siRNA NLRP2組星形膠質細胞中Bcl-2蛋白顯著增加(P<0.05)，Bax、caspase-3蛋白顯著降低，具有統計學意義(P<0.05)。

2.5沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞中NLRP2下游蛋白的影響 如圖5、表1所示，Pro-caspase-1蛋白在各組間的變化差異無顯著統計學意義；與對照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組caspase-1蛋白(P<0.05)、IL-1β蛋白(P<0.05)、P65蛋白(P<0.05)、p-P65蛋白(P<0.05)顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組相比，空載體組各蛋白差異無顯著統計學意義，siRNA NLRP2組星形膠質細胞中caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白(P<0.05)顯著降低，具有統計學意義。

圖3 沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of silencing NLRP2 expression on apoptosis in OGD-injured Note: Compared to control group,*.P<0.05;compared to model group,#.P<0.05.

圖4 沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞凋亡蛋白的影響Fig.4 Effect of silencing NLRP2 expression on apoptotic proteins in OGD-injured

圖5 沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞中NLRP2下游蛋白的影響Fig.5 Effect of silencing NLRP2 expression on downstr-eam protein in OGD-injury Note: Compared to the model group,*.P<0.05.

表1 沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞凋亡蛋白的影響

Note：Compared to control group,1)P<0.05;compared to model group,2)P<0.05.

表2 沉默NLRP2表達量對OGD損傷細胞中NLRP2下游蛋白的影響

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

3 討論

NLRP2是NLRPs家族中的成員之一，存在于細胞質中，由多種細胞系分泌、表達。目前關于NLRP2的研究較少，主要集中在胚胎發育、流產等方面[11，12]，NLRP2在中樞神經系統中的作用上不清楚。在本研究中，通過氧糖剝奪實驗構建腦缺血損傷的細胞，發現NLRP2在OGD損傷的星形膠質細胞中的表達量顯著增加，提示NLRP2參與機體腦缺血損傷的發生、發展過程。利用siRNA技術抑制NLRP2表達后，檢測顯示細胞中NLRP2的表達量較模型組顯著降低，表明轉染成功，可用于后續實驗。

目前，NLRP2炎癥小體已成為機體炎癥反應的重要組成部分，通過促進Pro-caspase-1裂解為具有活性的caspase-1，激活和放大促炎細胞因子如IL-1β的作用，從而誘導腦缺血損傷后導致的神經元凋亡及神經細胞的死亡[13-15]。研究發現，NLRP2可與caspase-1組成炎性小體，調控NF-κB信號通路的活性[16，17]。NF-κB主要由P65和P50兩種異源二聚體構成，對細胞的增殖、凋亡發揮關鍵作用[18-20]。本實驗研究結果顯示，OGD損傷的星形膠質細胞中，細胞凋亡率顯著增加，Pro-caspase-1蛋白的表達量無顯著變化，caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白水平顯著增加；沉默NLRP2的表達量顯著降低細胞的凋亡，抑制caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白的表達，表明NLRP2通過激活caspase-1，誘導機體炎癥反應的產生，調節NF-κB信號通路從而調控星形膠質細胞的凋亡，減輕腦缺血損傷。

Bcl-2主要通過與Bax的結合、水解，抑制細胞的凋亡。Bcl-2也可直接與凋亡蛋白因子結合，抑制caspase家族蛋白的激活[21，22]。caspase-3是caspase家族在細胞凋亡過程中關鍵的蛋白因子、多種凋亡信號通路共同的下游靶因子、細胞凋亡蛋白級聯反應的樞紐，可直接促進細胞的凋亡[23，24]。既往研究表明，在神經細胞受損的過程中，Bcl-2基因首先被激活，抑制細胞凋亡，其中caspase-3也參與腦缺血損傷的保護作用[25]。在本實驗中，氧糖剝奪后星形膠質細胞中Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax、caspase-3蛋白水平顯著增加，表明Bcl-2等細胞凋亡信號通路參與腦缺血損傷中神經細胞的凋亡過程；抑制NLRP2的表達量，顯著促進Bcl-2水平、抑制Bax、caspase-3蛋白表達，表明沉默NLRP2可能通過調控細胞凋亡信號通路降低神經細胞的凋亡，從而對腦缺血損傷發揮保護作用。

綜上所述，本研究通過構建氧糖剝奪星形膠質細胞模型，發現NLRP2參與腦缺血損傷過程；沉默NLRP2可通過誘導炎癥反應，調控NF-κB和細胞凋亡信號通路，阻礙神經細胞的凋亡，從而對腦缺血損傷發揮一定的保護作用，為腦缺血損傷的治療提供潛在的靶位點。