促胰島β細胞增生的黃酮類化合物的活體篩選

王沖，林春雨，吳志強，李明玉

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.廈門大學藥學院，福建 廈門 361102)

隨著天然藥物相關技術的發展，越來越多的天然藥物被人們所發現，由此帶來的對其活性進行篩選的需求也隨之增加。傳統意義上的藥物篩選，通常是基于分子靶點和細胞表型分析進行的藥物篩選[1]。但是這種體外篩選的方式并不能直接反應藥物在體內的作用效果。近年來，隨著藥物篩選的發展，越來越多的以小型動物，如：秀麗線蟲、果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾為模型進行體內藥物篩選的方式正快速發展[2-3]。這種將藥物直接作用于個體水平的篩選方式，不僅能夠直接反應出藥物對生物體的毒性影響，而且能夠更加全面地反應出藥物對整個生物體的影響[4-6]。由于斑馬魚具有眾多適合藥物篩選應用的優點，如：胚胎透明、便于觀察；繁殖率高、成本較低；體型較小、便于操作等。因此，以斑馬魚為模型進行藥物篩選正得到越來越廣泛的應用[6-7]。

本文利用斑馬魚的這一特點，以斑馬魚為模型進行黃酮類化合物的藥物篩選。黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，廣泛分布于各種植物組織中，如：荷葉、蒲公英、金銀花葉、橘皮、竹葉等[8]。在植物體內，黃酮類化合物通常與糖類結合形成苷類化合物。據報道，黃酮類具有多種醫藥學功能，如降壓、降糖、降血脂、抗氧化等[9-12]，但具體的機理尚不清楚。

本文主要探究黃酮類藥物的降糖功效與胰腺β細胞數量之間的相互關系。糖尿病以1型和2型為主，1型糖尿病是自體免疫性疾病，由自體免疫系統破壞產生胰島素的β-細胞引起的[13]。2型糖尿病主要由胰島素抵抗及胰島素相對缺乏引起的[14]。這兩種糖尿病的最終發病都會引起胰島β-細胞數量減少或者功能損傷，從而降低胰島素的分泌[15]。而尋找促進胰島β-細胞增生的藥物，以期用在糖尿病治療上一直是科學領域的研究熱點[16]。本文采用β-細胞特異性表達mCherry的轉基因斑馬魚Tg(-1.2ins:H2BmCherry)為模型，進行黃酮類化合物促β-細胞增生的活性篩選。并通過指示β-細胞復制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)][17]，以及指示β-細胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)[18]進行進一步分析。整個篩選操作簡單，方法便捷高效，可為黃酮類藥物在糖尿病領域的進一步開發提供理論基礎。

1 儀器、實驗試劑以及實驗動物

1.1 儀器 電子天平(舜宇恒平儀器)；體式熒光顯微鏡Leica M165FC(萊卡公司)；正置熒光顯微鏡AXIO IMAGER AI (蔡司公司)；共聚焦顯微鏡Zeiss LSM5(蔡司公司)。

1.2 實驗試劑 二甲基亞砜(DMSO，生工，批號：D807BA001)；潑尼松龍(MCE ，批號：50-24-8)；磷酸緩沖液(10X PBS，BBI 生命科技，批號：EB12FA0001)； 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Thermo fisher，批號：15630080)； 多聚甲醛(PFA，生工，批號：D606BA0003)； 間氨基苯甲酸乙酯(Sigma公司，批號：MKBX0252V)； 黃酮類藥物(成都植標化純生物技術有限公司)； Amplex Red 試劑盒 (Invitrogen A12222)。

1.3 實驗動物 野生型斑馬魚(AB); Tg(-1.2ins:H2BmCherry)轉基因斑馬魚; TgBAC(neurod:eGFP) 轉基因斑馬魚; Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]轉基因斑馬魚。

2 實驗方法

2.1 實驗動物-斑馬魚的養殖以及魚卵的收集培養

2.1.1 斑馬魚的飼養 斑馬魚的飼養是按照標準的飼養方法：每天3次投喂顆粒飼料，早晚各喂養一次豐年蟲卵，并給予適宜的光照(光照∶黑暗=14∶10)和溫度(25 ℃)，并利用堿泵和鹽泵調節適宜的pH(pH為7左右)和電導率(電導率為500左右)進行培養。

2.2.2 魚卵的收集及培養 在夜間避光環境下將一雌一雄的斑馬魚共同放置在同一配魚缸里，第二天白天光照的刺激下，收集沉落在配魚缸缸底的受精卵。將其放置在魚卵培養箱中培養5～6 d，培養箱中的溫度維持在28.5 ℃，光照∶黑暗的時間比為14∶10。在培養期間，每天都應更換新鮮的斑馬魚水溶液，以維持斑馬魚生活環境的清潔。

2.2 斑馬魚的藥物處理 轉基因斑馬魚Tg(-1.2ins:H2BmCherry)、Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]、TgBAC(neurod:eGFP)產生的胚胎發育至第5天，轉移至24孔板中，將每一孔中加入2 mL的斑馬魚水溶液、10條魚和2 μL的藥物(終濃度為10 μmol·L-1),并處理24 h。藥物處理時，以 DMSO為空白對照組，以潑尼松龍(Prednisolone，10 μmol·L-1)為陽性對照組。

2.3 斑馬魚的固定、胰島β細胞的成像和計數 藥物處理過斑馬魚胚胎用4% PFA進行過夜固定。固定好的斑馬魚胚胎，轉移至載玻片上，并使右側朝上，在其上面滴加適量封片劑進行封片。封片完畢后，利用斑馬魚自身的胰島β細胞所帶有的熒光蛋白進行共聚焦顯微成像和細胞數量統計。

2.4 斑馬魚血糖含量的測定 利用Amplex Red 試劑盒測定斑馬魚幼魚的葡萄糖含量。每10條魚勻漿于100 μL的緩沖液中，然后利用離心的方法清除勻漿。按照試劑盒的要求，每10 μL的上層清液就等同于一條幼魚，對每條魚的血糖進行測量。室溫下孵育30 min。然后通過酶標儀測量其熒光值，設置的波長分別為：激發光：520 nm，發射光：580～640 nm。藥物處理時，以 DMSO為空白對照組，以羅格列酮(RGZ,10 μmol·L-1)為陽性對照組。每一組應做3個重復。

3 實驗結果

3.1 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞的增生作用分析 我們選取了11種不同的黃酮類化合物，包括脫水淫羊藿素、淫羊藿素、香葉木素、柳穿魚黃素、高黃芩素(野黃芩素)、甘草查爾酮C、芫花素、羥基芫花素、穗花杉雙黃酮、洋艾素和銀杏雙黃酮。利用Tg(-1.2ins:H2BmCherry)斑馬魚胚胎，對這些化合物進行篩選。結果發現，對照組的β細胞為(32.67±1.922)，潑尼松龍作為陽性藥物，也能夠增加β細胞的數量。而黃酮類化合物中，柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮與空白對照DMSO相比，能夠增加紅色胰島β細胞的數量，分別為(37.60±1.951)、(37.53±1.786)、(45.00±2.714)、(33.77 ±2.612)和(37.33±2.762)(見圖1～2)。我們選取高于DMSO組的化合物進行下一步分析。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.甘草查爾酮C;H.芫花素;I.羥基芫花素;J.穗花杉雙酮;K.洋艾素;L.銀杏雙黃酮;M.陽性對照；與空白對照組比較，**P<0.01圖1 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞增生作用的篩選

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽性對照圖2 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞增生作用共聚焦拍攝圖

3.2 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞的復制作用分析 由于胰島β細胞的增生的來源之一為已有的β細胞的復制。我們選取了5個促進β細胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細胞復制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]進行分析。在該模型中，胰島β-細胞特異性表達S/G2/M期的特異性蛋白Geminin，并以mAG(monomeric Azami green)-Geminin 融合蛋白的形式展現，經過復制的細胞會表達綠色熒光[16]。藥物處理24 h后，結果發現，與空白對照組相比，淫羊藿素和陽性藥潑尼松龍能夠促進綠色β細胞的復制，數量分別為：(2.750±0.491 0)和(5.636±0.855 7)，高于對照組的(1.556±0.242 2)(見圖3～4)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.陽性對照；與空白對照組比較，*P<0.05，***P<0.001圖3 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞復制的作用分析

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽性對照圖4 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞復制的作用共聚焦拍攝圖

這些結果表明，在這些黃酮類藥物中，柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮能夠增加β細胞的數量。而淫羊藿素促進β細胞的增加部分來源于β細胞自身的復制。

3.3 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細胞的分化作用分析 由于胰島β細胞增生的另一來源為胰島前體細胞分化為成熟β細胞。我們選取了促進5個β細胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)進行分析。在該模型中，neurod是胰島前體細胞的標記基因之一，來源于前體細胞的新β-細胞將表達eGFP綠色熒光[18]。柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮等藥物對TgBAC(neurod:eGFP)處理24 h后，我們統計了誘導分化的β細胞的數量。結果發現，與空白對照組相比，柳穿魚黃素能夠促進β細胞的分化，數量分別為(5.667±0.881 9)，高于對照組的(3.000±0.577 4)(圖5～6)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖5 黃酮類化合物對斑馬魚β細胞分化作用的分析

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖6 黃酮類化合物對斑馬魚β細胞分化作用的分析共聚焦拍攝圖

3.4 黃酮類化合物對斑馬魚血糖水平的統計分析 由于脫水淫羊藿素、淫羊藿素、柳穿魚黃素、芫花素、銀杏雙黃酮、潑尼松龍能促進β細胞數量的增加，因此我們還進一步對藥物處理的斑馬魚進行血糖水平的測量。結果發現柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素都能夠降低斑馬魚的血糖，血糖值分別為：(153.5±2.202)、(171.2±12.25)、(171.6±6.978)pmol，明顯低于空白對照組的(288.1±22.58)pmol。這些結果說明，這幾種黃酮類藥物具有降低血糖的作用(見圖7)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍;H.陽性對照；與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖7 黃酮類化合物對斑馬魚血糖水平的影響分析

4 分析與討論

本文以斑馬魚為模型進行黃酮類化合物的藥物篩選，以期尋找到能夠促進胰島β細胞增生的藥物。這些研究結果為將來開發黃酮類化合物用于糖尿病的治療提供了參考依據。在以β細胞數量為指標的篩選過程中，我們發現柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮共5種黃酮類化合物能夠促進胰島β細胞的增生。為進一步分析這些增生的胰島β細胞是通過復制還是分化而來，我們進行了進一步的探究。我們分別利用指示β-細胞復制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]和指示β-細胞分化的模型TgBAC(neurod:EGFP)，對促進β細胞增生的化合物進行藥物處理。結果發現，淫羊藿素能夠誘導β-細胞的復制，但并不能誘導前體細胞的分化，說明了淫羊藿素促進β-細胞的增加部分來源于自身的細胞復制。當然，它促進增生的β-細胞的數量大于復制增加的細胞數量，說明還有一些其他的機制參與β-細胞數量的增加。而柳穿魚黃素促進通過誘導分化增加的β-細胞的數量與增生的數量大致相同，說明其促進β-細胞的增生主要歸功于誘導前體細胞的分化。

由于胰島β細胞的增加可能會引起胰島素分泌的增加，從而可能起到降低血糖的作用。我們在分析化合物對血糖水平影響的分析中發現，這些有3個促進β-細胞增生的黃酮類化合物在不同程度上都能起到降低血糖的作用。但是由于斑馬魚血糖水平的調節受到多種信號通路的影響，這些能夠促進β細胞數量增加的藥物是如何參與血糖水平的調控，還需進一步的研究。