p62基因沉默對宮頸癌Hela細胞生長和藥物敏感性的影響

婁歡，馬金平，武明莉，楊小風

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院婦產科，河南 鄭州 450000)

長期的臨床隨訪研究認為，宮頸柱狀上皮細胞癌的發生率可達374～583/10萬人左右[1]。臨床上宮頸癌患者容易早期發生淋巴結轉移，遠期生存轉歸較差，而無進展生存時間均較短[2]。不同的腫瘤相關基因或者相關蛋白，均能夠影響宮頸癌細胞的特性，導致癌細胞的分化、耐藥或者凋亡等病理特征的改變。P62基因是細胞自噬相關基因，P62基因的表達能夠通過影響到細胞的自噬、癌細胞有絲分裂等過程，進而抑制癌細胞的凋亡，導致癌細胞有絲分裂速度的增快。P62基因的表達能夠影響到內質網伴侶分子的表達，進而提高上皮細胞的核基因轉錄活性，導致癌細胞的擴增速度的增快[3]。部分研究者探討了P62基因在鼻咽癌患者中的表達情況，認為P62基因的表達濃度的上升能夠導致鼻咽癌細胞的浸潤能力和復發風險的上升[4]，部分研究者探討了P63基因與宮頸癌的關系，但多數限于流行病學研究。為了揭示P62基因的表達與宮頸癌細胞的生物學特征關系，從而為臨床上宮頸癌患者的臨床診療提供理論基礎，本次研究通過細胞基因水平的轉染沉默P62基因表達后，觀察了宮頸癌細胞的特征改變，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌Hela細胞株為本院保存，短發夾RNA（shRNA）慢病毒載體購自上海吉瑪制藥技術有效公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 shRNA慢病毒載體轉染 采用無內毒素質粒提取試劑盒提取和純化P62抑制劑質粒及空白質粒，測定濃度，將宮頸癌Hela細胞鋪于六孔板上，隔日更換DMEM高糖培養基，在細胞融合度為75%～80%時加入脂質體和構建的質粒，并進行p62－shRNA篩選，定期更換培養基清除死亡的細胞。檢測藥物耐藥性前對照組、空白組及慢病毒轉染組均給予 0.05mg/L、0.5mg/L 和 5mg/L 順鉑處理。

1.2.2 CCK法檢測 在 96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），向每孔加入 10μL CCK8 溶液，將培養板在培養箱內孵育1～4h，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入 10μL 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，24h內測定，吸光度不會發生變化。

1.2.3 RT－PCR檢測 收集細胞進行裂解，收集細胞裂解液，加入 0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機中離心(12000g/min，15min)，反復一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入P62基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20pmol/ul，制備反應體系，RT－PCR擴增的條件與 參 數 ：48℃ ，45min，94℃ ，2min；94℃ 30s，58℃60s，68℃ 2min共40個循環；循環完畢后68℃延伸7min。 ShRNA序列5’外側cttgccacaggtctccccaa 3’外側 aggggtcagaggcaagcaga。

1.2.4 流式細胞儀檢測 采用annexin/PI法檢測細胞凋亡，采用刮匙刮取培養基中的細胞，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，2000r/min離心10min，去除上清液。采用預先混合的緩沖液進行重新懸浮細胞，加入10ul的PI和10ul的annexin進行染色，混勻后4℃放置10min，采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（x±s）表示，多組間比較使用方差分析或重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組 p62 mRNA相對表達比較 p62－shRNA組p62 mRNA相對表達量明顯低于對照組和空白shRNA 組（P＜0.05），見表 1。

表1 各組p62 mRNA相對表達比較

2.2 各組Hela細胞增殖情況比較 p62－shRNA組培養24h、48h、72h細胞OD值明顯低于對照組和空白 shRNA 組（P＜0.05），見表 2。

2.3 各組Hela細胞凋亡率比較 p62－shRNA組細胞凋亡率明顯高于對照組和空白shRNA組 （P＜0.05），見表 3、圖 1。

2.4 順鉑處理后各組細胞存活率比較 0.05mg/L、0.5mg/L和5mg/L順鉑作用下，p62-shRNA組細胞存活率明顯低于對照組和空白shRNA組 （P＜0.05），見表 4。

表2 各組Hela細胞增殖情況比較

表3 各組細胞凋亡率比較（%）

圖1 流式細胞儀檢測圖

表4 順鉑處理后各組細胞存活率比較（%）

3 討論

臨床上宮頸癌的發生主要考慮與高危型HPV病毒感染導致的宮頸柱狀上皮細胞持續性病變有關，流行病學研究證實，在HPV16或者HPV18感染的人群中，宮頸鱗狀細胞癌的發生風險可進一步的上升[5，6]。長期的臨床觀察認為，宮頸癌患者的無進展生存時間不足34個月，綜合性治療措施治療后的3年內病死率仍然超過了25%以上[7]。免疫靶向治療能夠在宮頸惡性腫瘤的治療過程中發揮重要作用，其能夠通過沉默相關基因或者蛋白的表達，進而抑制宮頸癌細胞的復發和轉移，輔助治療宮頸惡性腫瘤[8，9]。而本次研究對于宮頸癌細胞中P62基因功能的表達分析研究，能夠為臨床上宮頸癌的免疫靶向治療提供參考靶點。

P62基因是調控細胞自噬和凋亡的基因，其表達的P62蛋白能夠導致上皮細胞多種生物學特征的改變，導致上皮細胞的線粒體損傷、內質網功能障礙并促進細胞有絲分裂等過程。P62基因的高表達能夠導致癌細胞對于基底膜組織的突破能力的增強，導致癌細胞間質成分的分解，從而促進了腫瘤細胞的擴散和轉移[2]。基礎領域相關的臨床研究認為，P62基因的表達能夠導致腫瘤干細胞活性的增強，提高腫瘤干細胞自我增殖能力，加劇了癌細胞的持續性擴增的風險[10]。

本次研究中通過對于P62基因進行沉默，可以發現沉默表達P62基因組的細胞株中P62基因表達水平明顯的下降，提示了轉染的成功。對于不同組別宮頸癌細胞株的生物學特征的分析可見，沉默表達P62基因的癌細胞，其增殖活性明顯的下降，提示了P62基因對于維持宮頸癌細胞株的增殖特性具有重要的作用，通過匯集不同的相關文獻，筆者認為P62基因對于宮頸癌細胞株增殖特性的維持作用，主要考慮與P62基因的下列幾個作用有關[11，12]：⑴P62基因能夠提高宮頸癌細胞核DNA上游啟動子的活性，導致癌細胞的轉錄活性的增加；⑵P62基因能夠通過激活宮頸癌細胞內的MAPK或者NOTCH信號通路，進而提高了宮頸癌細胞的增殖速度。梁冠男等[13]研究者也認為，在過度表達P62基因的宮頸癌中，癌細胞的浸潤能力明顯的增強，同時癌細胞的增殖速度明顯加快，高于P62基因低表達的宮頸癌患者。在探討P62基因對于宮頸癌細胞凋亡特性的影響過程中可以發現，P62基因沉默表達后，宮頸癌細胞的凋亡速度明顯增加，高于P62未沉默表達組，差異較為明顯，提示了P62基因對于宮頸癌細胞的凋亡具有顯著的抑制作用，P62基因對于癌細胞凋亡的影響，主要通過對于內質網分子伴侶的影響，導致內質網氧化應激水平的改變，提高了線粒體的ATP合成活性，進而提高了癌細胞的增殖水平，抑制了腫瘤細胞的凋亡[14]。但部分研究者并不認為P62基因的表達與宮頸癌細胞的凋亡有關，認為P62基因負載后，宮頸癌細胞的凋亡比例并無明顯的下降[15]，這主要考慮與不同宮頸癌細胞株的選擇或者P62基因的負載程度的差異有關。最后本次研究通過不同濃度的順鉑進行癌細胞的耐藥性檢測，可以發現順鉑處理后的各組細胞均存在明顯的凋亡現象，但P62基因沉默組患者的細胞存活率較低，提示P62基因對于維持癌細胞的存活狀態，提高癌細胞的存活能力具有重要的作用。

本次研究的創新性在于探討了P62基因沉默表達后的宮頸癌細胞株的生物學特征的改變。綜上所述，p62基因沉默可抑制宮頸癌Hela細胞增殖，促進細胞凋亡，增加對順鉑的敏感性。