南昌地區RhD陰性獻血者DEL型檢測及分析

張瑩瑩，余真強，熊建平，陳火玲，杜忻，徐晶

(南昌市中心血站，江西 南昌330025)

DEL型作為RhD血型中的一種特殊變異體，其輸血安全性一直存在爭議。已有研究學者提出將DEL型從RhD陰性獻血者中篩選出來，避免產生同種異體免疫[1，2]。在中國，陰性人群中DEL型占有較高的比例，且遺傳學背景非常復雜，DEL型的準確鑒定對確保陰性患者的臨床輸血安全具有重要的指導意義[3－5]。為調查南昌地區RhD陰性獻血者中DEL表型分布以及與各地DEL型表型分布進行比較，本課題應用酸吸收放散及PCR－SSP實驗方法從RhD陰性獻血者中篩查DEL表型并進行基因分型，為制定南昌地區DEL型輸血策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2017年2月至2018年1月南昌市中心血站RhD陰性獻血者樣本，共計107例。

1.2 試劑與儀器 抗－A、抗－B試劑、ABO紅細胞、抗體篩選細胞 （上海血液生物醫藥有限責任公司）；抗－AB 試劑（法國 DIAGAST）；凝聚胺試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司)；IgM型單克隆抗－D試劑、IgG型單克隆抗－D試劑 (上海血液生物醫藥有限責任公司)；IgM+IgG型單克隆抗－D試劑(英國Millipore（UK）Ltd)；人源抗－D 血清(我站自制，抗體效價＞256)；抗－C、抗－c、抗－E、抗－e 單克隆抗體檢測試劑（上海血液生物醫藥有限責任公司）；酸吸收放散試劑（廣州展全生物科技有限公司）；引物、DNA 提取試劑盒（Innotrain）；Taq 酶（Promega）；久保田離心機（KA－2002）；GRIFOLS 離心機（DGTherm）；GRIFOLS 孵 育 器 （DGSpin）；PCR 擴 增 儀（SimpliAmp）；凝膠成像儀（G：BOX F3）。

1.3 方法

1.3.1 RhD陰性確認 對鹽水法初篩為RhD陰性的樣本用抗人球蛋白法確認，并進行C、c、E、e抗原分型。

1.3.2 酸吸收放散 將確認為RhD陰性的樣本取200μl紅細胞，洗滌3次制成壓積紅細胞，加入等體積人源－D，混合均勻，37℃水浴30min，洗滌6次制成壓積紅細胞，將等體積酸放散試劑加入吸收紅細胞，迅速混勻離心，3400r/min，離心1min，取放散液100μl，將pH調節劑滴入放散液調至中性，加入50μl O型RhD陽性紅細胞，37℃水浴1h，用微柱凝膠方法檢測放散結果。

1.3.3 PCR－SSP 將酸吸收放散陽性的 5 例 DEL 型樣本送至廣州血液中心，通過PCR－SSP方法進行RhD基因檢測。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件對數據進行卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RhD陰性獻血者表型分布 107例RhD陰性獻 血 者 中 ccee 53 例 （49.53% ），Ccee 37 例（34.58% ），CCee 11 例 （10.28% ），CcEe 3 例（2.80%），ccEe 3 例（2.80%）。

2.2 中國各地區RhD陰性獻血者DEL型分布特征 107例陰性獻血者中檢出DEL型30例（28.04%），與上海地區比較差異有統計學意義（χ2=6.02，P＜0.05），與其它地區比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 南昌與各地RhD陰性獻血者DEL型分布比較

2.3 DEL型獻血者表型分布 檢出DEL型30例，占比為 28.04%，其中 Ccee 23 例（76.67%），CCee 7例(23.33%)，與各地區DEL型獻血者表型分布無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

表2 南昌與各地DEL型獻血者表型分布比較

2.4 PCR－SSP基因分型結果 5例DEL型標本第9外顯子均有1227G＞A突變，其中雜合子4例，純合子1例，見圖1。

圖1 PCR-SSP基因分型結果

3 討論

RhD是繼ABO血型系統之后最重要的血型系統，在臨床輸血、自身免疫性溶血以及新生兒溶血中有著重要意義[10－12]。DEL型作為特殊的RhD變異體，其重要性受到廣泛關注。本研究顯示，在南昌地區的107例RhD陰性獻血者中30例為DEL型，占 28.04%，除與上海（P＜0.05）地區存在統計差異外，與其它地區無統計學差異。DEL型在南昌地區RhD陰性獻血者中占比較高，因此深入研究DEL型對提高臨床輸血安全性具有重要意義。

本研究的30例DEL型樣本中，RhCE表型主要為 Ccee（76.7%）和 CCee（23.3%），與浙江、上海、臺灣和福州的研究結果相似 （P＞0.05），說明DEL型與Ce單倍體關系密切，可能與RhD基因和RhCe 基因緊密連鎖有關[13－16]。

對于RhD陽性個體來說，至少擁有一條正常RHD基因，RhD陰性個體的主要分子機制在于RHD基因的完全缺失，而DEL表型形成的主要分子機制為RHD基因1227G＞A突變。PCR－SSP結果顯示5例標本第9外顯子均有1227G＞A突變，其中4例純合子，1例雜合子，說明RhD 1227A是南昌地區DEL表型個體的重要遺傳標記。

在中國，DEL型在RhD陰性人群中占比較高，且一直將DEL當作RhD陰性用于臨床輸血。而在國內外均有RhD陰性受血者輸注DEL型紅細胞產生抗－D同種免疫的文獻報道[17－20]。因此，增加樣本量、調查DEL型分布特點、進一步揭示DEL型遺傳背景以及基因多態性，對提高臨床輸血安全性具有重要意義。