清腦益元湯調(diào)控HIF-1α、VEGF和PDGF表達(dá)在大鼠腦缺血損傷中的保護(hù)機(jī)制研究

韓艷茹，賈奎，趙福成

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺血性卒中是因多種病因造成腦動脈閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)興奮性毒性、線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥、離子失衡及酸中毒，最終導(dǎo)致腦組織不可逆性損傷，神經(jīng)細(xì)胞壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能及認(rèn)知功能缺失[1，2]。缺血所引起的腦組織損傷是致死性疾病的主要原因，是全世界第三大致死疾病之一，具有高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率及高復(fù)發(fā)率的特點[3，4]。其中，缺血再灌注損傷發(fā)生在急性腦梗死恢復(fù)血液供應(yīng)后，重新獲得血液供應(yīng)的腦組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞死亡增多，腦組織損傷加重。近些年來，許多中藥被發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注早期可緩解腦組織損傷情況，并可減少海馬細(xì)胞的死亡[5，6]。因此，本研究旨在探究清腦益元湯大鼠腦梗死缺血再灌注中的主要作用機(jī)制，及對腦內(nèi)HIF-1α、VEGF、PDGF調(diào)節(jié)情況。

1 材料與方法

1.1 大鼠MACO模型制備[7]45只成年雄性Wistar大鼠SPF級 （購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）。相對濕度40%～70%，晝夜12h循環(huán)光照，溫度適宜。將SD大鼠按設(shè)計方案分成組，每組3組，每組15只；隨機(jī)分為對照組、模型組、清腦益元湯組。采用灌胃方法在造模后分別灌注14d等劑量的生理鹽水或清腦益元湯。采用10%水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉（35mg/kg），仰臥位固定大鼠，切開皮膚病分離左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），在CCA遠(yuǎn)心端近心端及ECA處掛線備用。用動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎 CCA、ECA。然后在距 CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當(dāng)插入深度在18mm時，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線。栓塞1h后，打開栓塞制作再灌注模型。做完模型后，終止麻醉，將所有大鼠歸放籠里。

清腦益元湯：水牛角30g、水蛭 8g、赤芍 15g、參三七 10g、川牛膝 15g、紫河車 15g、紅景天 20g、干地黃10g、制首烏10g、肉蓯蓉10g。煎藥直至其變?yōu)楦酄睿幬餄舛群?g/ml。大鼠按照3ml/100g清腦益元湯灌胃14d，對照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.2 大鼠Longa評分[8]動物蘇醒后，參照Longa等評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分為模型成功，0分和4分予以剔除，并在后續(xù)實驗中補(bǔ)足每組動物數(shù)。

1.3 采樣與指標(biāo)檢測 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，留取大腦海馬組織，中性福爾馬林（10%）固定，常規(guī)組織脫水和浸蠟包埋，石蠟5μm/張切片連續(xù)6張，切片用于HE染色和TTC檢測觀察腦組織形態(tài)變化和顏色變化，計算梗死面積。

1.4 Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平 離心大鼠腦組織提取海馬區(qū)蛋白，調(diào)整每一組的蛋白濃度總量為30ug/uL。各組蛋白樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，加入大鼠多克隆抗體 HIF－1α、VEGF、PDGF和二抗。顯色使用 ECL顯色劑，成像使用Bio－Pro凝膠成像分析儀，各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量用Quantity－one軟件進(jìn)行分析。

1.5 Real－Time PCR 法檢測基因表達(dá) Trizol法提取大鼠腦組織內(nèi)總RNA。按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行實時熒光定量Real－time PCR分析。每個實驗HIF－1α、VEGF、PDGF至少重復(fù)3次。 分析：通過計算 HIF－1α、VEGF、PDGF 得到循環(huán)閾值CT值來確定基因的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 本實驗各組數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件處理，對數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料，計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和Bonferroni "s Multiple Comparison Test進(jìn)行組間差異比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)組織學(xué)評分結(jié)果 對照組大鼠腦組織呈均勻紅色，未見蒼白缺血區(qū)；模型組損傷腦組織可見蒼白梗死灶，且缺血灶范圍隨再灌注時間的延長而擴(kuò)大；清腦益元湯組大鼠腦組織缺血面積明顯減少。與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠Longa評分明顯增高，梗死面積（%）明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與模型組相比，清腦益元湯組大鼠Longa評分明顯降低，梗死面積（%）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 大鼠神經(jīng)組織學(xué)評分結(jié)果

2.2 HE染色結(jié)果 對照組大鼠腦海馬回神經(jīng)細(xì)胞胞膜、核膜清晰，核仁明顯細(xì)胞形態(tài)無異常。模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞，多無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈不同程度的缺血性壞死，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃縮集聚，甚至形成核碎片，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈簇樣增生。清腦益元湯組缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞腫脹程度、間隙及細(xì)胞核改變均較輕，腦缺血區(qū)僅有輕、中度缺血性改變，缺血區(qū)腦梗死現(xiàn)象明顯減輕。見圖1。

2.3 Western blot法檢測蛋白表達(dá)結(jié)果 與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF－1、VEGF、PDGF的蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組HIF－1蛋白含量明顯降低，VEGF、PDGF蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖 2。

圖1 HE染色結(jié)果(400×)

圖2 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF的蛋白表達(dá)含量

2.4 Real-Time PCR法檢測蛋白表達(dá)結(jié)果 與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組 HIF-1 mRNA含量明顯降低，VEGF、PDGF mRNA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。 見圖 3。

圖3 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA表達(dá)水平

3 討論

中醫(yī)藥現(xiàn)如今在干預(yù)和治療腦組織疾病中具有顯著療效，不僅可以活血化瘀、解毒清腦，幫助機(jī)體恢復(fù)腦內(nèi)血流量，改善腦缺血損傷的局部微環(huán)境，改善腦缺血損傷程度；還可以益腎填精、補(bǔ)腎生髓，用于修復(fù)和改善缺血壞死的腦神經(jīng)元，降低神經(jīng)功能缺損。清腦益元湯由水牛角、水蛭、赤芍、參三七、川牛膝、紫河車、紅景天、干地黃、制首烏、肉蓯蓉10味中藥組成，水牛角清熱涼血解毒；水蛭破血逐瘀、活血通絡(luò)；赤芍清熱涼血；參三七活血化瘀；川牛膝活血通經(jīng)絡(luò)；紅景天活血化瘀、健脾益氣；紫河車補(bǔ)腎益精、補(bǔ)氣益血；地黃、制首烏及肉蓯蓉填精益髓益腎固元，功效為清腦祛瘀、益腎生髓，使腦絡(luò)通暢，局部血液供應(yīng)改善，梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損加速修復(fù)，擬用于腦缺血損傷大鼠急性期和恢復(fù)早期階段的防治[9-11]。

HIF-1α是機(jī)體在低氧狀態(tài)下做出適應(yīng)性反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)性因子。缺氧時HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β聚合成HIF-1，HIF-1與血管內(nèi)皮因子結(jié)合介導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，激活相關(guān)的缺血缺氧轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)受損腦組織中新生血管生成[12，13]。 同時，HIF-1α可參與介導(dǎo)顱腦損傷中的神經(jīng)元凋亡作用。HIF-1α是一種用于檢測低氧環(huán)境的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在顱腦損傷所致的缺血缺氧腦損傷發(fā)生、發(fā)展過程中HIF-1α發(fā)揮著十分重要的作用。在發(fā)生了腦缺血損傷后，相比于損傷發(fā)生之前，大腦內(nèi)VEGF的表達(dá)顯著的提高[14]。VEGF作為目前最強(qiáng)的血管通透因子，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管的通透性，能夠被激活或者直接促進(jìn)血管的生成，研究表明VEGF能夠提高機(jī)體腦組織內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的存活和促進(jìn)細(xì)胞增殖[15，16]。血小板衍生因子（PDGF）在結(jié)締組織細(xì)胞參與傷口愈合時表達(dá)明顯升高，PDGF通過增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的合成和分泌，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原蛋白的形成，可以大大降低傷口愈合的時間。國內(nèi)外研究表明，PDGF及其受體能夠促進(jìn)毛細(xì)血管壁的形成和穩(wěn)定，促進(jìn)血管生成和血管重建，并可通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，能對細(xì)胞起保護(hù)作用，緩解腦部損傷[17，18]。

本研究結(jié)果表明，清腦益元湯可以有效緩解Longa評分，并可以有效改善大鼠的行為學(xué)變化，減輕大鼠腦組織腦缺血損傷情況，改善損傷海馬區(qū)不同程度的缺血性壞死和神經(jīng)元損傷。清腦益元湯能夠顯著降低大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α含量表達(dá)，并促進(jìn)VEGF、PDGF mRNA和蛋白含量表達(dá)以改善大鼠腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)腦內(nèi)新生血管生成，保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元。綜上所述，清腦益元湯對腦損傷大鼠的治療作用可為腦梗死的臨床治療提供新的理論依據(jù)、可能思路和靶向藥物。