miRNA-21對宮頸癌Hela細胞順鉑化療增敏作用的研究

徐文莉，李康，王娟，林燕華，廖長征，羅藝，張洪德

(深圳市龍崗中心醫院中心實驗室，廣東 深圳518116)

宮頸癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，發病率在全球范圍惡性腫瘤中位居第四位，死亡率在20～39歲婦女中高居第二[1]。85%的宮頸癌病例發生在發展中國家僅次于乳腺癌，我國子宮頸癌發病例數居世界國家第二位[2，3]，在我國女性生殖系統腫瘤中居首位[4]。目前的主要治療方式為手術、放療、化療和綜合治療[5]，其中化療在宮頸癌中的作用越來越受到國內外的重視，順鉑作為一線化療藥物用于治療宮頸癌，但部分患者在數個化療后，會產生耐藥從而影響療效導致高死亡率。因此，如何提高宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性及抑制腫瘤細胞的侵襲轉移是目前宮頸癌治療中急需解決的問題。研究顯示microRNAs在調節腫瘤細胞對化療藥物敏感性方面起著重要作用，miRNA－21是體內重要的miRNAs之一，與腫瘤化療耐藥密切相關。PTEN是一個抑癌基因，與細胞耐藥密切相關。但是在宮頸癌鉑類耐藥相關的研究目前文獻報道較少。本研究通過研究宮頸癌Hela/DDP在順鉑誘導的細胞凋亡中miRNA－21、PTEN的變化，探討miRNA－21及PTEN在逆轉宮頸癌Hela/DDP順鉑耐藥的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌親本細胞株Hela、耐藥細胞株Hela/DDP購自中科院上海生化細胞所細胞庫，總RNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司，microRNA－21 siRNA 及陰性對照 （microRNA－21 neg）及U6引物購自廣州銳博生物科技有限公司，PI及 Anexin－FITC Apop Detecter kit試劑盒購買于美國BD公司，MTT試劑盒購買于北京博奧龍免疫技術有限公司，DPP－順氯氨鉑 （美國sigma公司），MEM培養基（美國Hyclone公司），新生牛血清（美國Gibco公司），細胞培養瓶及培養板（美國Corning公司），PTEN抗體 （Abcam公司）。儀器：CO2培養箱購買于美國Thermo公司，FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司，VIIA7實時熒光定量PCR儀購買于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量 PCR 收集培養 24h后的Hela細胞、轉染24h后的Hela/DDP細胞，提取總RNA，Multiskan go酶標分析儀檢測RNA純度及濃度，OD260/OD280 吸光度比值在 1.8－2.0 間滿足要求。以U6作為內參，逆轉錄引物5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’ 反應條件：95℃，5min；40個 PCR 循環 （95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s；78℃，20s（收集熒光）；為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃（每5s升高 1℃）。 miR－21 5’TGCGTGTCGTGGAGTC3，反應條件：95℃，5min；40 個 PCR 循環 （95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s；78℃，20s（收集熒光））。 為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃（每5s升高1℃）。以U6為內參照， 以 2－ΔΔCt法表示相對表達量，ΔΔCt=（Ct實驗－CtU6）實驗組－（Ct對照－CtU6）對照組，CT 為每個反應管中的熒光信號達到所設定閾值時所經歷的循環數。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 收集轉染后的宮頸癌Hela/DDP細胞分別接種于96孔板，約5×103個/孔，置37℃、5%CO2溫箱培養24h后，向每孔細胞中加入DDP10μg/ml，培養72h后每孔加入180μl新鮮DMEM培養液，再加入20μl MTT溶液（5mg/ml），繼續培養4h后，去除孔內培養液。每孔加入DMSO 100μl，置搖床上低速振蕩 10min，使結晶物充分溶解。在Multiskan go酶標儀570nm處測量各孔的吸光值。抑制率=（對照組OD值－實驗組OD值）/對照組OD值。

1.2.3 PI法檢測腫瘤細胞周期 胰酶消化細胞后，收集細胞懸液離心，棄去上清液，用PBS洗滌2次，調整細胞濃度在在1×105個/ml左右，加入碘化丙啶（PI），室溫避光30min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4 流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡 細胞懸液處理同 1.2.3 步驟， 取 100μl細胞懸液與 7－AAD 5μl以及FITC AnnexinV 5μl混合充分混勻，置于室溫 （20～25℃） 避光 15min， 加 400μl 1×Binding Buffer在1h內上機檢測。

1.2.5 Western blot法檢測細胞中 PTEN 蛋白的表達 收集轉染后72h后的細胞，按照實際說明書操作步驟，提取細胞中總蛋白，進行聚丙酰胺凝膠電泳，后轉移至醋酸纖維膜上，脫脂牛奶室溫封閉。2h后加入PTEN及β－Actin抗體，置于搖床4℃孵育過夜，PBS洗膜后加入辣根過氧化酶抗體，用ECL化學發光試劑盒進行顯影，凝膠成像分析系統進行分析。

1.3 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，計量資料符合正態分布的采用均數±標準差（x±s）x 表示，兩組間比較采用 t檢驗，三組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢測人宮頸癌親本細胞Hela組、耐藥細胞株Hela/DDP組中miR－21表達差異 實時熒光定量PCR結果顯示：miR－21在Hela/DDP 組中表達量 4.251±0.018，明顯高于 Hela組1.000，差異具有統計學意義（P=0.041）。 見圖 1。2.2 Real－timePCR 檢測 Hela/DDP 組、 轉染后Hela/DDP siRNA組及Hela/DDP陰性組中miR－21表達差異。

細胞轉然后miRNA－21的表達，結果顯示miR－21－siRNA 組表達量為 1.501±0.013，均低于空白對照組 4.251±0.018，P=0.041 及 miR－21－neg 組4.321±0.011，P=0.039，差異均有統計學意義，空白對照組與 miR－21－neg 組相比，P=0.752，差異無統計學意義。見圖2。

圖1 轉染前miR-21在Hela/DDP及Hela中的表達

圖2 轉染后miR-21在空白對照組、miR-21-neg組及miR-21-siRNA組中的表達

2.3 MTT檢測順鉑對 siRNA及陰性對照轉染Hela/DDP和無轉染Hela/DDP的抑制率。

pSIREN－miR－21干擾載體抑制Hela/DDP細胞的增殖， 抑制率為 58.458.4±1.41 明顯高于空白對 照 組 34.2 ±1.11，P=0.038 和 miR －21 －neg 組35.3±1.32，P=0.039，差異均有統計學意義，空白對照組和 miR－21－neg 組比較 P=0.862， 差異無統計學意義。見圖3。

圖3 DDP作用72h各組細胞的抑制率

2.3 流式細胞術分析細胞周期的變化 miR－21－siRNA組的G0/G1期細胞比例明顯升高 70.12±2.17， 與空白對照組 46.51±2.14，P=0.035 及 miR－21－Neg 組 45.27±1.15，P=0.031，S 期及 G2/M 期細胞比例明顯下降 21.54±2.11 vs 32.58±3.17、33.27±2.19 P=0.042，P=0.039；8.31±1.15 vs 21.15±2.87、22.58±3.19 P=0.022，P=0.019。 miR－21－neg 組與空白對照組相比，不同細胞周期間差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見圖 4。

圖4 DDP作用72h各組細胞周期

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 流式細胞儀雙染法檢測結果顯示，siRNA轉染Hela/DDP組凋亡率 32.62±3.25 高 于 空 白 對 照 組 10.85±0.27，P=0.014 和 miR－21－neg 組 11.14±0.21，P=0.019，差異均有統計學意義。見圖5。

2.5 PTEN蛋白的表達 Western blot檢測各組細胞中PTEN蛋白的表達水平，發現siRNA轉染組PTEN蛋白表達量為0.53±0.08明顯升高空白對照組 0.28±0.02，P=0.025 和 miR－21 －neg 組 0.27 ±0.01，P=0.023。 見圖 6。

3 討論

圖5 DDP作用72h各組細胞的凋亡率

圖6 DDP作用72h各組細胞的PTEN蛋白表達水平

順鉑臨床上常用的一種腫瘤化療藥物，可以有效地抑制腫瘤，但在治療過程中經常出現耐藥顯現，導致化療不佳。研究發現腫瘤耐藥與MicroRNAs（miRNAs）的異常表達有關。 miRNAs是一種長約22nt的非編碼小分子單鏈RNA，在腫瘤的發生發展中起著重要角色，主要通過負向調控相關靶基因的表達在系列疾病病理生理過程中起著重要作用[6]。miR-21是體內重要的miRNAs之一，通過靶向調控多種細胞凋亡相關基因，促進細胞增殖，對抗細胞凋亡，不僅參與多種腫瘤的發生發展和侵襲轉移過程，而且與腫瘤化療耐藥密切相關[7-10]。PTEN名為與張力蛋白同源，第10染色體丟失的硫酸酶基因，是迄今為止發現的第一個具有雙特異性磷酸酶(DPS)活性的抑癌基因，能夠通過復雜的信號轉導通路調控細胞周期、腫瘤侵襲轉移和細胞耐藥等過程。前人實驗證明，PTEN是miR-21的重要靶基因，miR-21通過PTEN調控宮頸癌細胞的惡性生物學行為，是宮頸癌發生發展及侵襲轉移的重要調節機制。通過抑制Hela和caSki細胞中miR-21表達，能有效增加PTEN蛋白表達，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。由于PTEN介導的PI3K/AKT通路是體內重要的抗凋亡轉導途徑，其異常激活能夠促進宮頸癌細胞對鉑類耐藥的發生。因此，我們有理由假設，miRNA-21在逆轉宮頸癌耐藥方面發揮重要的調控作用。

本研究結果顯示，通過Hela/DDP細胞中的miRNA-21表達明顯高于親本細胞Hela，提示宮頸癌耐藥與miRNA-21表達上調有關。通過siRNA干預Hela/DDP細胞后，miRNA-21表達下調，給予順鉑作用后，MTT結果顯示Hela/DDP細胞增殖抑制率明顯升高，流式細胞儀分析提示細胞凋亡率升高，同時影響細胞周期的進程，將細胞停滯于G0/G1期。從而證實下調Hela/DDP細胞miRNA-21后，對順鉑的敏感性增強，凋亡程度提高，逆轉了宮頸癌Hela/DDP細胞對順鉑的耐藥性。實驗研究顯示，siRNA轉染Hela/DDP細胞并給于順鉑作用后，其PTEN蛋白表達明顯提高，細胞增殖活性下降，這與文獻報道一致[11-14]。實驗證明，PTEN是miRNA-21的重要靶基因，miRNA-21通過PTEN調控宮頸癌細胞的惡性生物學行為，是宮頸癌發生發展及侵襲轉移的重要調控機制[15，16]。本實驗顯示抑制miRNA-21的表達，PTEN蛋白表達上調，提高對順鉑化療藥物的敏感性，提示miRNA-21調控PTNE蛋白在逆轉宮頸癌Hela/DDP細胞順鉑耐藥中同樣具有重要作用。

綜上所述，抑制Hela/DDP細胞中miRNA-21表達，上調PTEN蛋白表達水平，增加宮頸癌Hela/DDP細胞對順鉑誘導的凋亡和敏感性。本研究為了解miRNA-21在逆轉宮頸癌Hela/DDP細胞化療藥物中的作用提供了新的見解，為提高宮頸癌藥物敏感性的靶向治療提供了重要依據。