磁微粒化學發光法檢測兒童IGF-1的方法學性能評價

李瑞，張耀東，趙鼎，孫紅啟，楊俊梅，李進香

(鄭州大學附屬兒童醫院；河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室；鄭州兒童醫院，河南 鄭州450018)

胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor，IGF-1）也被稱作“生長介素”，是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽，由肝臟和其它多種組織所分泌[1]，近年來很多研究表明[2-4]，IGF-1是聯系營養和生殖的紐帶，是青春發育啟動的重要信號之一。在嬰兒的生長和在成人體內持續進行合成代謝作用上具有重要意義。臨床上已作為常規檢測指標判斷兒童骨骼生長狀況。

磁微粒化學發光法是檢測該項目的一種敏感、特異的快速檢測方法。根據美國臨床實驗室改進修正案和ISO15189等文件對實驗室質量的管理要求和實驗室認可的要求[5，6]，檢測系統在用于臨床之前必須對其分析性能進行驗證。本研究通過AutoLumo A2000檢測系統測定IGF-1的分析靈敏度、分析內精密度、分析間精密度、線性范圍、回收實驗和參考區間，以驗證廠商給定的性能參數，為臨床應用該項目提供準確、詳實、可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集我院2017年11月-12月就診患兒的新鮮血清標本，按照要求分為高、低濃度，冰箱-20℃凍存備用。

1.2 儀器和試劑 全自動化學發光測定儀（AutoLumo A2000），胰島素樣生長因子-1檢測試劑盒（豫械注準20152400476）

1.3 方法

1.3.1 分析靈敏度 將試劑盒中零濃度校準品（S0）重復測定10次，得出10次測量結果的RLU值（相對發光值），計算其平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD的RLU值，將M+2SD帶入lin-log擬合的標準曲線方程中，求出對應的濃度值，即為分析靈敏度。

1.3.2 分析內精密度 按照CLSI EP5-A2文件要求[7]，選擇安圖公司配套的高、低值質控品（批號：2017081601）作為精密度評價的樣本進行檢測，1d內連續測定10次，分別計算均值（x），標準差（S）和變異系數（CV）。

1.3.3 分析間精密度 將上述兩種濃度的混合血清每天測定5次，連續測定3d，分別計算均值（x），標準差（S）和變異系數（CV）。

1.3.4 線性范圍 按照CLSI EP6-A2文件要求[8]，取 IGF-1高值（H）和低值（L）血清各 1份，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L 和 5L 稀釋，形成系列濃度血清進行測定，以稀釋后的理論值為X，實測值為Y，將所有結果標在坐標圖上，計算回歸方程：Y=bX+a驗證線性范圍，判斷標準為b值在0.97～1.03 范圍內，相關系數 R2≥0.9900。

1.3.5 回收實驗 將高值混合樣本A（濃度為535.6745ng/ml）加入到低值混合樣本B（濃度為51.8905ng/ml）中，樣本A與樣本B的體積比例為1：4，配置成樣本 C（濃度為 105.983ng/ml），分別測量樣本A、B和C，各重復2次，計算平均值作為檢測值，比較實際檢測值和理論值的差異，計算回收率R，回收率應在80～100%范圍內。

1.3.6 干擾實驗 按照CLSI EP7-P文件要求[9]，⑴溶血干擾物：取新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加蒸餾水配制，血紅蛋白(Hb)濃度分別為5、3、l g/L；⑵三酰甘油(TG)干擾物：取高血脂患者樣本加蒸餾水配制，TG濃度分別為12、6、3mmol/L；⑶膽紅素干擾物：取黃疸患者樣本加蒸餾水配制，總膽紅素(TBil)濃度分別為 150、100、50umol/L；⑷計算：低水平樣本和高水平樣本各分成2份，每份樣本重復測定5次計算分析干擾值：干擾值=T-C，即各組均值-未加干擾物相應組的均值。干擾值在對照組1.96s(95%可信區間)范圍內為無顯著干擾。

1.3.7 參考區間 選擇在線性范圍內的高值樣本1份，用系統稀釋液按照說明書最大稀釋倍數5倍進行稀釋，測定原高值樣本和稀釋后樣本各2次，得出靶值(原值均值)和測定值（稀釋后樣本均值M×5），計算檢測值與靶值的相對偏倚（%）。偏倚=[（測定值-靶值）/靶值]×100%。

2 結果

2.1 分析靈敏度驗證結果 10次S0發光值均值為178788，SD 為 54025，均值+2SD 為 286838，得出最低檢測限即分析靈敏度為5.81ng/ml。

2.2 精密度驗證結果 分析內精密度驗證結果為低、高值樣品（CV%）分別為6.31%和5.65%；分析間精密度驗證結果為低、高值樣品（CV%）分別為6.46%和8.09%。均小于廠商提供的數據 （不大于10%）。見表1。

2.3 線性范圍驗證結果 選取IGF-1高濃度（839.653ng/ml）和低濃度（54.548ng/ml）血清，稀釋后的理論值和實測均值見表2，散點圖見圖1，結果顯示 Y=1.027X-50.77，R2=0.9929。 b=1.027 在0.97～1.03 范圍內，R2≥0.9900， 故 IGF-1 濃度在15～1000ng/ml范圍內線性良好。

表1 精密度實驗驗證結果（ng/ml）

表2 線性范圍驗證（ng/ml）

2.4 回收實驗驗證結果 將高低值血清樣本按比例混合后上機檢測，根據檢測值和理論值計算回收率R為105.70%，見表3。

表3 回收率驗證（ng/ml）

2.5 干擾實驗驗證結果 TBil濃度高達150umol/L、TG濃度高達12mmol/L時，測定的IGF-1高、低水平樣本的干擾值均在干擾限度值 （1.96s）范圍內，均不構成干擾。而Hb低于5g/L時使IGF-l的濃度明顯下降。

圖1 IGF-1線性分析

2.6 參考區間驗證結果 原值兩次測定結果均值為737.5645ng/ml稀釋樣本兩次測定結果均值為140.8105ng/ml，偏差為-4.54%，符合標準要求：偏差不大于±20%，試劑盒參考范圍可滿足15～5000ng/ml的要求。

3 討論

IGF是一類既有胰島素樣合成代謝作用，又有促生長作用的單鏈多肽，血中90%的IGF-1由肝臟合成。目前發現，IGF有IGF-1和IGF-2兩種。IGF-1是GH依賴的生長因子，IGF-1作為一個重要的有絲分裂原，在機體中的主要作用是促進細胞的生長分化，而IGF-2是重要的胚胎生長和發育調節因子，GH的大部分生物學效應是由肝、腎等組織依賴所產生的IGF-1介導[10，11]。生后隨年齡的增長，IGF-1水平緩慢升高，直到青春發育前大致與成人相似，青春發育期IGF-1水平急劇升高，為成人水平2倍以上，持續幾年后下降，18歲以后達成人水平，50歲后呈緩慢下降的趨勢[12，13]。因此，臨床工作中常常用血清IGF-1水平來協助診斷生長激素缺乏癥，或對使用生長激素治療的兒童進行用藥的安全監測和療效評估。

磁微粒化學發光法檢測IGF-1的原理是采用雙抗體夾心法。用抗人IGF-1抗體包被于酶標板上，實驗時標本或標準品中的IGF-1會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗人IGF-1抗體與結合在包被抗體上的人IGF-1結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入發光底物混合液，發光底物在辣根過氧化物酶的催化下發出熒光，用化學發光免疫分析儀測定化學發光值（RLU），IGF-1濃度與化學發光值之間呈正相關，通過繪制標準曲線求出標本中IGF-1的濃度。

任何分析方法都存在一定的誤差，為保證高質量的臨床實驗室服務，對選定的方法經過初步試驗之后或用于臨床常規檢測之前以及在對原有檢測系統進行修改后，實驗室須對該方法進行嚴格、系統的技術性能評價或對廠家所提供的技術性能指標進行驗證[14]。美國病理家學會(CAP)要求申請認可的實驗室在開展新檢測項目前，需要根據本實驗室條件對廠家提供的性能參數進行驗證方可使用[15]，為此CLSI出臺了一系列EP指南文件，本研究根據相應的EP文件進行評價，EP5-A2為定量測量方法的精密度性能評價方案，是目前評價測量方法精密度最全面、最具統計學效能的方法；EP7-A2為臨床化學干擾試驗-批準指南，其干擾篩選方案是目前較為常用的方法；EP6-A2為定量測量方法的線性評價方案是多項式評價方法中具有代表性的方法[16]。方法學驗證最重要的指標是準確度和精密度。本研究通過回收實驗驗證準確度，計算平均回收率R為105.70%，符合標準要求。本實驗中黃疸和脂血抗干擾能力較強，而溶血狀態抗干擾能力較弱，建議在臨床報告結果中注明標本存在的可能干擾因素，提醒臨床注意。精密度是檢測系統的主要分析性能之一，更是其他性能評價的基礎。精密度是體現重復性的重要性能指標，本研究結果顯示，磁微粒化學發光測定IGF-1的低、高值混合血清分析內精密度CV分別為6.31%和5.65%，分析間精密度CV分別為6.46%和8.09%，均符合標準要求：不大于15%。線性范圍驗證的目的是驗證該方法的最高檢測值和高、低檢測值之間是否呈線性關系，其評價有助于發現儀器、校準品、試劑和操作規程等方面的誤差來源，本研究通過系列比例稀釋，檢測IGF-1水平，驗證對數據進行多項式回歸分析，通過目測圖1可看出多項式的擬合曲線近為重合，所有數據幾乎均落在一條直線上，初步判斷最佳的擬合形式為直線，且數據的精密度較高，證實在該濃度范圍內稀釋的幾個點為直線方程，結果表明實測濃度與理論濃度之間相關性良好，R2為0.9929。

綜上所述，通過對IGF-1的分析靈敏度、分析精密度、線性范圍、回收率、干擾實驗和參考范圍的評價和分析，證實AutoLumo A2000檢測系統應用磁微粒化學發光免疫分析技術測定IGF-1的靈敏度高、精密度好、結果準確可靠，性能可滿足臨床檢測的要求。