Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β聯合檢測對慢性牙周炎感染的診斷價值分析

趙芳，黃婷，李娟

(鄭州市第一人民醫院口腔科，河南 鄭州 450000)

流行病學研究顯示，慢性牙周炎的發病率具有進一步的上升趨勢[1]。臨床上慢性牙周炎的發生發展能夠導致牙周袋的形成，促進牙齒的松動，增加失牙的風險。不同的生物學因子特別是炎癥相關因子的表達，能夠通過影響成纖維細胞的凋亡，降低結締組織的張力及支持功能，促進慢性牙周組織的炎癥性疾病的發生。Wnt[2]信號通路的激活能夠通過維持局部自身免疫因子的表達，提高局部牙周組織的抗炎癥損傷能力；分泌型卷曲相關蛋白 1(secreted frizzle.relatedprotein 1，SFRPl)的表達能夠通過調控Wnt3a信號通路的激活，從而抑制Wnt3a信號通路的上調，提高下游單核細胞或者巨噬細胞對于牙周組織的浸潤[3]；不同的炎性小體均能夠影響到組織損傷的發生過程，而其中炎癥小體（NLRP3）近年來被認為顯著影響到了口腔炎癥性疾病的發生過程，NLRP3的上升能夠導致牙周組織細胞的膜完整性的破壞，導致牙周支持結構的破壞，導致慢性牙周損傷[4，5]。為了進一步揭示 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL－1β 等在慢性牙周炎中的表達情況，從而為慢性牙周炎的早期診斷提供依據，本次研究選取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作為研究組，探討了相關指標的表達及其與患者病情的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作為研究組，男 42 例，女 48 例，年齡 25～50 歲，平均(33.85±3.14)歲。按其附著喪失(CAL)程度將患者分為輕中重3個等級。另選取該時段來我院體檢的90例健康者作為對照組，其中男33例，女57例，年齡25～50 歲，平均(30.17±3.82)歲。

納入標準：①經檢查確診為慢性牙周炎感染的患者；②半年內未服用過抗生素、免疫抑制劑藥物者；③患者及家屬知情同意并配合治療。

排除標準：①合并糖尿病、類風濕等全身性系統疾病者；②長期吸煙酗酒者；③合并惡性腫瘤、嚴重心肝腎疾病的患者；④月經、妊娠或哺乳期婦女；⑤精神病患者。

1.2 檢測方法 酶聯免疫吸附法檢測Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 的含量：采集齒齦溝液體 3ml，加入 Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 單抗，標本和標準品中的Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 會與單抗結合，PBS液體洗滌5min。按照1：500的比例加入羊標志的一抗5ml，4℃放置過夜，PBS緩沖液洗滌3 次，每次 5min，加入鼠來源的二抗（1：1000）2ml，室溫放置2h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值。

采用RT－PCR檢測Wnt3a水平：在提取液體中加入 0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機中離心(12000g/min，15min)，反復一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC 使其終濃度均為 20pmol/ul，制備反應體系，RT－PCR擴增的條件與參數：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40個循環；循環完畢后68℃延伸7min。

1.3 統計學分析 選用統計學軟件SPSS 16.0對研究數據進行分析和處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）進行統計描述，計數資料采用 χ2檢驗；組間比較采用t檢驗；P值＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組牙周組織中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表達水平比較 與對照組相比，研究組Wnt3a的mRNA 表達顯著下調（0.41±0.02），差異有統計學意義 （P＜0.05）。研究組Wnt3a蛋白表達顯著下調（0.39±0.28），差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組牙周組織中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表達水平比較

2.2 不同CAL程度患者SFRPl的濃度比較 與對照組相比，除輕度牙周炎患者外，中、重度患者的SFRPl濃度均明顯升高，差異有統計學意義 （P＜0.05）。 見表 2。

2.3 兩組牙周膜細胞中NLRP3及IL－1β的表達比較 與對照組相比，研究組牙周膜細胞中NLRP3和 IL－1β 表達上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 不同CAL程度患者SFRPl的濃度比較

表3 兩組牙周膜細胞中NLRP3及IL-1β的表達比較（pg/ml）

3 討論

現階段臨床上慢性牙周炎的發生率具有顯著的上升趨勢，特別是在合并有糖尿病、高血壓或者自身免疫性疾病的人群中，慢性牙周炎的發病均具有進一步的上升趨勢。臨床上慢性牙周炎的發生能夠增加患者遠期牙周組織的破壞和牙齒脫落的風險[6]。但慢性牙周炎的早期診斷水平較低，臨床早期多不具有顯著的臨床癥狀，診斷較為困難，口腔內鏡檢查等的費用偏高且難以廣泛開展。血清學指標的檢測在感染性疾病的診斷過程中發揮了重要的參考作用，其檢測較為方便、經濟，可開展性較高、容易普及。本次研究的現實意義在于：⑴能夠為臨床上慢性牙周炎患者的早期診斷提供血清學參考指標；⑵能夠為臨床上慢性牙周炎的生物學治療提供理論基礎。

Wnt3a信號通路的激活能夠提高局部分泌型IgA的濃度，提高局部抗氧化或者抗病原體侵蝕的能力，特別是Wnt3a蛋白的表達上升能夠增加其巨噬細胞吞噬厭氧菌或者牙菌斑微結構的能力，促進病原體的清除[7]；SFRP1作為Wnt3a信號通路上重要的效應因子，SFRP1的表達濃度的改變能夠拮抗Wnt3a的下游因子的激活作用，降低Wnt3a對于局部牙齦溝中液體微環境的保護作用[8]；NLRP3及IL－1β均是炎癥因子相關成分，NLRP3及IL－1β的表達上升能夠提高局部炎癥因子的富集程度，促進局部趨化因子或者補體成分的激活，增加中性粒細胞酶對于牙周組織的分解作用，增加炎癥細胞對于牙周組織的浸潤[9，10]。部分研究已經探討了Wnt3a信號通路上部分因子在慢性牙周炎局部齒齦溝中的表達情況，認為相關指標的異常表達是促進病情進展、導致牙周組織破壞的重要因子，但對于SFRP1、NLRP3及IL-1β等的分析研究不足。

本次研究通過齒齦溝或者牙周組織細胞中的相關因子的表達分析發現，Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白在齒齦溝或者牙周組織細胞中的表達濃度均明顯上升，高于正常良性牙周組織，差異具有統計學意義，提示Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的異常表達可能影響到了慢性牙周炎的發生過程，相關指標的高表達能夠通過影響Wnt3a信號通路的調控，促進慢性牙周炎的發生[11-13]：⑴Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的下降失去了對于下游游離狀態的體液因子的促釋放作用，導致牙周組織的自身抗凋亡能力的下降；⑵Wnt3a信號通路沉默導致的局部微環境的改變，能夠增加牙菌斑的形成風險，增加牙周組織成纖維成分的分解速度。程煥芝等[14]研究者在探討了72例慢性牙周炎患者的齒齦溝中的相關因子的表達后發現，Wnt3a蛋白陽性表達率平均下降25%以上，同時患者的慢性牙周炎的病程越長、牙周組織的破壞越為嚴重，Wnt3a蛋白的下降越為明顯。附著喪失是評估慢性牙周炎患者病情嚴重程度的重要指標，在附著喪失越為嚴重的患者中，SFRPl的表達濃度上升越為明顯，提示了SFRPl與慢性牙周炎患者的病情密切相關，SFRPl能夠通過影響局部牙周組織中的金屬蛋白酶的活性，實現對于患者牙周炎組織的破壞作用，提高牙周組織的分解及牙齒的破壞。采集病變較為明顯的牙周炎組織患者的病灶，檢測蛋白水平的表達，發現牙周膜細胞中NLRP3及IL-1β的表達濃度明顯上升，二者是評估患者體內局部炎癥反應程度的指標，牙周膜細胞中NLRP3及IL-1β的表達上升提示了炎癥小體或者炎癥介質在慢性牙周炎病情進展過程中的重要作用。但部分學者并不認為IL-1β的高表達具有普遍性，IL-1β的高表達主要與疾病的急性發作、牙齦短期內破壞加劇、牙齦萎縮、牙槽骨的分解和侵蝕等過程有關[15]。

綜上所述，慢性牙周炎患者感染可引起牙周組織中Wnt3a蛋白表達下調，齦溝液中的SFRPl含量升高，牙周膜細胞中NLRP3及IL-1β表達上調，說明 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL-1β 可能在促進慢性牙周炎患者的病情進展過程中發揮了重要的調控作用。