MTDH和Wnt5b在乙肝相關性肝癌組織中的表達和意義

萬鐵林，馮廣帥

(安陽市第五人民醫院，河南 安陽 455000)

肝癌即肝臟惡性腫瘤，可分為原發性和繼發性兩大類。原發性肝癌主要為肝細胞癌(HCC)，其病因及確切分子機制尚不完全清楚[1]，近年來肝癌的基礎研究不斷取得新的進展[2－4]，但發病率和病死率仍呈逐年升高趨勢[5]，中國肝癌的發病率和死亡率位于世界較高水平[6，7]。而在我國感染乙型肝炎病毒是肝癌發病的主要原因，我國肝癌患者中的乙型肝炎病毒感染率約占90%[8，9]，乙型肝炎病毒X蛋白是引起HCC最主要的原因，乙型肝炎相關性發病機制復雜，目前尚無特效的治療性藥物。因此，探索新的治療靶點是目前治療乙型肝炎相關性的關鍵所在[10]。

隨著精準醫學時代的到來，我們認識到HCC的發生發展是多基因相互作用的過程，同時涉及多種細胞信號轉導通路。異黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，它調節著眾多信號通路，在促進腫瘤細胞的增殖、轉移及侵襲中發揮重要作用。而人類Wnt基因家族由19個家族成員組成[11]，Wnt信號通路主要參與各種內環境穩態的維持以及胚胎的正常發育過程，在眾多惡性腫瘤中，MTDH基因和Wnt5b的表達上調，如乳腺癌、膀胱癌等。然而，一直未有MTDH和Wnt5b在HCC組織中表達情況及作用機制的系統研究。

本研究探討了乙肝相關性HCC組織中MTDH及Wnt5b表達與患者臨床病理特征的關系，同時檢測了乙肝相關性HCC組織中MTDH mRNA及Wnt5b mRNA的表達情況，為今后研究MTDH和Wnt5b在肝癌發生、發展中的信號傳導機制提供實驗論證。

1 材料與方法

1.1.1 材料 總RNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物有限公司），逆轉錄試劑盒 （購自大連Takara生物有限公司），免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒，兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體（購自美國Abcam 公司），山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP（PV－6000）（購自北京中杉金橋生物技術有限公司），兔抗人甘油醛－3－磷酸脫氫酶單克隆抗體及鼠抗兔單克隆二抗（均購自武漢博士德生物有限公司），一抗稀釋液（P0103）（購自上海碧云天生物技術有限公司），PCR引物為上海生工生物公司合成，其它試劑為國產分析純試劑。紫外分光光度計(日本HITACHI)，PCR儀 (美國ABI公司)， 顯微鏡 （德國Kruess公司）。

1.1.2 標本來源 肝癌患者知情，同意外科手術后，取腫瘤組織，其中男29例、女25例；另收集2例外傷致肝破裂切除的部分組織作為正常組織。將標本均分為兩組，一組用于組織提取，在液氮中冰凍保存，另一組則加入多聚甲醛，在室溫下固定，流水漂洗后，室溫過夜，包埋，零下保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 標本用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片厚度為4μm，在65℃下烘烤2h，用二甲苯脫蠟60min，水化用梯度酒精，低溫微波修復抗原10min，將其冷卻至室溫，再加入3%過氧化氫浸染20min，然后加入1%BSA封閉30min，一抗4℃孵育過夜，用PBS溶液洗3次，每次2min，次日加入二抗室溫孵育30min，加入DAB顯色，水洗充分后，再用蘇木素染核10min，緊接著1%鹽酸酒精進行分化，加氨水藍化，用乙醇梯度脫水，二甲苯使透明，最后封片。

1.2.2 組織總RNA抽提 分別取已經凍存于液氮罐的乙肝相關性HCC組織，提取RNA（操作按試劑盒說明書進行）。用紫外分光光度計測定總RNA純度和含量，在260nm和280nm處的紫外吸光度值比值在 2.0±0.1 之間。 取 RNA 2μg進行逆轉錄，操作過程按試劑盒說明和相關文獻[12]進行，PCR實驗中所使用的引物見表1。

表1 RT-PCR中使用的引物

2 結果

2.1 MTDH和Wnt5b在乙肝相關性肝癌組織的表達及相關性 免疫組化檢測MTDH和Wnt5b在乙肝相關性肝癌組織中均有表達，54例乙肝相關性肝癌組織中MTDH表達陽性率為77.78%，Wnt5b表達的陽性率為70.37%，采用SPSS 17.0進行統計處理，統計分析發現，MTDH及Wnt5b表達陽性與患者的年齡、性別、無相關性，但與腫瘤直徑顯著相關（P＜0.05），見表 2。

2.2 乙肝相關性肝癌組織中MTDH和Wnt5b表達的臨床病理學特征 通過對54例確診肝癌病例肝組織、2例正常肝臟對照組織進行免疫組化檢測，結果表明肝癌組織有MTDH和Wnt5b表達，且肝癌組織中MTDH明顯高于正常肝臟組織，正常肝臟組織中幾乎未發現明顯的MTDH表達，而正常肝臟組織中的Wnt5b的表達明顯高于肝癌組織，顯微鏡下見乙肝相關性HCC組織中MTDH主要表達于胞漿，部分表達于細胞核，而Wnt5b表達主要在細胞核。見圖1。

表2 MTDH和Wnt5b在乙肝相關性肝癌組織的表達

圖1 免疫組化檢測MTDH及Wnt5b在肝癌組織中的表達(×200)

2.3 RNA提取及逆轉錄PCR檢測 對正常肝臟組織和肝癌組織應用RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA，并利用RT－PCR檢測MTDH、Wnt5b的mRNA相對表達量，我們發現肝癌組織中MTDH mRNA表達明顯高于正常肝臟組織，但肝癌組織Wnt5b mRNA的表達卻低于正常的肝臟組織，見圖2。

3 討論

圖2 不同肝臟組織中MTDH和Wnt5b mRNA表達水平

目前關于HCC發生機制表明，肝炎病毒感染（如乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒）及毒素（如黃曲霉毒素）或代謝等致病因素導致組織損傷后形成肝硬化和因為HCC中的癌基因或腫瘤抑制基因是占主導地位的兩種主要致病機制，兩者均與幾種重要的細胞信號傳導途徑的異常激活相關[13]，乙型肝炎病毒感染是肝細胞肝癌的首要致病因素，預防肝癌的最有效方法是將乙肝的病毒，載量控制在正常范圍，隨著近年來靶向治療技術的迅猛發展，已證實靶向作用于信號傳導通路中的關鍵基因有助于逆轉、延遲或阻止腫瘤發生[14]。而對于已確診的乙肝相關性肝癌患者是否有必要進行分子靶向藥物治療還有待研究。因此，探索HCC演進的分子機制及尋求其演進過程中潛在的治療靶點無疑具有十分重要臨床意義。

癌基因、抑癌基因在腫瘤發生的不同階段會出現不同的功能異常，是一個不同的信號轉導通路分子的多基因參與調控的復雜過程。如今發現參與了HCC的發生和進展過程的基因多達數十種，而MTDH和Wnt5b是近幾年發現了一些與HCC相關的新基因。MTDH是個高度保守的基因，近年的研究顯示，MTDH在多種人類腫瘤中過表達，是在人免疫缺陷病毒1感染或腫瘤壞死因子α處理過的人原始胚胎星形膠質細胞中表達升高的基因，檢測其表達程度有助于對HCC在臨床上進行早期診斷，MTDH對腫瘤來說是一個有效的評估預后的生物學標志物，參與多個重要的信號調控通路，這其中包括三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及轉錄激活蛋白-1（AP-1）等信號通路[15]，它們在促進腫瘤細胞的增殖、轉移侵襲中發揮重要作用，例如Haras、NF-κB 和 Wnt/β-catenin。 MTDH 異常表達可導致腫瘤細胞的異常增殖、凋亡耐受、侵襲轉移、新生血管形成等，而它的具體調控機制則涉及多個信號轉導途徑和分子表達，但其致瘤機制并不完全明了，它可能是一個潛在的癌基因，而HBV感染可能是MTDH異常表達的一個始動因素。Wnt信號通路是一條在進化上極其保守的信號傳導途徑，Wnt信號通路包括經典Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路，目前研究較多的是經典Wnt/βcatenin信號傳導通路，研究發現它在胚胎發育、組織再生、造血、細胞增殖分化與遷移等過程和功能中發揮的作用十分關鍵[16]，在許多組織和器官干細胞的分化和更新過程中起到重要的介導作用[17，19]。國內HCC中Wnt信號傳導通路的研究目前主要集中于對其上游和或下游個別基因異常表達的探討，Wnt信號通路的異常激活已被證實與包括HCC在內多種腫瘤發生發展密切相關[18]。在家族成員中，Wnt5b作為Wnt通路眾多配體之一，Wnt5b參與了上皮細胞向間質細胞的轉化，進而影響腫瘤細胞的侵襲能力。

在本研究中，我們通過收集肝癌組織和正常組織分別檢測MTDH和Wnt5b的表達水平，在對正常肝臟組織和肝癌組織進行免疫組化和PCR擴增時，正常組織和肝癌組織中MTDH都有一定量的表達，但正常組織的表達明顯低于肝癌組，與周文波[12]發現正常的肝臟組織Wnt5b的表達比癌旁組織和肝癌組織要高相吻合。這一現象可能與肝癌的發生過程中激發了多個信號通路有關，從而使這一潛在的癌基因得以擴增及轉移，但這一癌基因是如何被激發的，有哪些信號通路得以表達仍需要作進一步檢測。在證實MTDH在HBV相關肝細胞癌組織中高表達的同時，Wnt5b在HBV相關肝細胞癌組織中低表達，正常組織中的Wnt5b表達明顯高于肝癌組織，在某種程度上，我們可以認為它對肝癌的細胞的異常增殖、遷移起到阻止作用，而這種阻止行為在某種程度上引起自身的消亡。實驗中我們還發現MTDH和Wnt5b的表達水平還與腫瘤直徑密切相關，這一發現與陶鵬輝[10]認為的MTDH和乙型肝炎HCC中的表達與患者年齡、性別無相關性，但與腫瘤直徑存在相關性相一致，但這種相關性與MTDH和Wnt5b兩者之間的表達量是否有直接關系，未有證實。我們知道HBV病毒HBX蛋白在HBV相關性HCC的發生中起關鍵性的作用，該蛋白廣泛參與了RAS/RAF/MAPK、Wnt/β -catenin、PI3K/AKT/ERK、JAK/STAT等信號通路及其下游分子 cyclin D、A、B、P21 cip1、GSK-3β等的功能調控[20]。所有這些結果均提示我們MTDH和Wnt5b可以被用來對HBV相關性HCC進行早期診斷、準確分期診斷，它們作為兩個新的生物學標志物，對患者用藥提供參考，MTDH與Wnt5b的表達存在明顯不同，但MTDH和Wnt5b與HBV病毒之間的關系依然不明了，在MTDH異常增殖時，Wnt5b是否起到保護及延緩肝癌細胞的擴增，遷移，在此次研究中還未得到相關的實驗論證，這需要作進一步的后續研究。