γ-萜品烯的體內(nèi)外抗氧化性研究

,

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

人工合成抗氧化劑(BHT、BHA等)在食品工業(yè)中被廣泛使用。但毒理學(xué)和生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),人工合成抗氧化劑對(duì)人體健康有一定的傷害,存在安全隱患[1-2]。因此,很多具有抗氧化性的天然產(chǎn)物及其提取物安全性高,在抗氧化劑研發(fā)中極具潛力和應(yīng)用價(jià)值[3-4]。香辛料精油就是其中的一類(lèi)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),從八角、生姜、胡椒、大蒜等常見(jiàn)香辛料中提取出的精油均具有一定的抗氧化性[5-7]。孜然也是一種常見(jiàn)的香辛料,目前有關(guān)其精油抗氧化活性的研究主要集中在幾種化學(xué)方法上,比如DPPH自由基清除法、β-胡蘿卜素-亞油酸體系法等[8-10]。化學(xué)抗氧化方法不能反映抗氧化成分在細(xì)胞內(nèi)的作用情況,若探究其在細(xì)胞內(nèi)的生物利用率、吸收和代謝等情況,必須建立相關(guān)細(xì)胞模型[11-12]。Wolfe等[13]以人體肝癌細(xì)胞Hep-G2為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?建立了細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)法。近幾年來(lái),該方法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于食物和純植物化學(xué)物質(zhì)等的抗氧化性評(píng)價(jià)中[14-16]。

國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)天然產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)[17-20],但有關(guān)孜然精油主要成分體內(nèi)抗氧化的研究未見(jiàn)報(bào)道。化學(xué)方法和細(xì)胞模型均屬于體外評(píng)價(jià)方法,并不能反映藥物在機(jī)體內(nèi)部的吸收和代謝情況。

本實(shí)驗(yàn)室曾利用化學(xué)方法對(duì)孜然精油及其主要成分的體外抗氧化性進(jìn)行了探究[21-22],結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-萜品烯為主要的活性單體,它可以有效清除DPPH自由基,并能在一定程度上延緩β-胡蘿卜素的褪色反應(yīng)。為進(jìn)一步深入研究γ-萜品烯抗氧化作用的機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,首先在細(xì)胞水平上開(kāi)展抗氧化評(píng)價(jià),通過(guò)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度和氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中幾種抗氧化酶活性的測(cè)定、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的測(cè)定,對(duì)γ-萜品烯的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。然后在細(xì)胞模型抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,向小鼠口服灌胃一定濃度的γ-萜品烯,對(duì)其血清和肝臟中的抗氧化酶活性、GSH和MDA含量等進(jìn)行測(cè)定,從而對(duì)其體內(nèi)抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

γ-萜品烯標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥ 98.5%,美國(guó)Sigma-aldrich公司;人肝癌細(xì)胞株Hep G2 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);細(xì)胞凍存管、25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、Costar 6孔板、24孔板、黑板透明底96孔板、普通酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司;50%戊二醛溶液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;30%過(guò)氧化氫溶液 西隴化工股份有限公司;2′,7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP) 美國(guó)Sigma-aldrich公司;Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) 賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(100×)、無(wú)菌PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、無(wú)菌二甲基亞砜(DMSO)溶液、組織/細(xì)胞裂解液(高效RIPA)、細(xì)胞凍存液、0.1%的結(jié)晶紫溶液、蛋白測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;高純二氧化碳、液氮 北京千禧京城銷(xiāo)售中心;ICR小鼠 共40只,雄性,體重19～24 g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證:SCXK-(京)2012-0001,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

CKX31倒置顯微鏡 日本Olympus公司;BP221S精密天平 德國(guó)SARTORIUS公司;AgileAid電動(dòng)移液器 美國(guó)ACTGene公司;ZK380型低溫低速離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司;2000D型超純水機(jī) 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南省湘儀集團(tuán);多功能酶標(biāo)儀 Tecan集團(tuán)奧地利有限公司;XK96-A快速混勻器 姜堰市新康醫(yī)療機(jī)械有限公司;HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YDS-30-125型液氮罐 樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司;1300 SERIES A2型生物安全柜 美國(guó)Thermo Scientific公司;Thermo Forma 370二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientific公司;YXQ-LS-100SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;WD-9405B型水平搖床 北京市六一儀器廠沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司;SIM-F140AY65-PC型制冰機(jī) 日本SANYO公司;-80 ℃冰箱 美國(guó)NBS公司;溫控水浴箱 北京長(zhǎng)風(fēng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.1.1 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[14]略作修改。

細(xì)胞的復(fù)蘇:將水浴鍋預(yù)熱至37 ℃,迅速取出液氮罐中的Hep G2細(xì)胞,將其投入水浴鍋中迅速解凍,然后在超凈臺(tái)中,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,加入3 mL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液,1000 r/min離心5 min。棄掉上清液,加入新培養(yǎng)液,輕輕吹打細(xì)胞重懸于培養(yǎng)瓶中,放置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),24 h后換液。

細(xì)胞傳代:當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用5 mL PBS洗一次,加入約1 mL胰酶消化3 min,待細(xì)胞變圓且貼壁能力下降時(shí),加入5 mL DMEM培養(yǎng)液終止消化,用吸管吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移至離心管中,1000 r/min離心5 min。棄掉上清液,將細(xì)胞重懸于新的培養(yǎng)液中,按1∶2 (v/v)移入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,放置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于黑板底部透明的96孔板中,每個(gè)孔約含6×104個(gè)細(xì)胞,加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基。37 ℃下培養(yǎng)2 h后移除培養(yǎng)基,每孔加入100 μL PBS,清洗兩次。然后加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液、γ-萜品烯樣品液、DCFH-DA熒光探針溶液,使得γ-萜品烯的質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/mL,DCFH-DA終濃度為25 μmol/L,每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù),在CO2培養(yǎng)箱(濃度5%、溫度37 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后棄掉培養(yǎng)基,每孔加入100 μL PBS,清洗3次,加入ABAP工作液使 ABAP的終濃度為600 μmol/L,用多功能酶標(biāo)儀測(cè)其熒光值,測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為538 nm,1 h內(nèi)每5 min測(cè)定一次。對(duì)照組用DCFH-DA和ABAP處理,不加入樣品液;空白組僅用DCFH-DA處理,不加入ABAP和樣品液，熒光強(qiáng)度=待測(cè)組測(cè)量值-空白組測(cè)量值。

1.2.1.2 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)[23]中的方法略作修改,具體操作如下:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-G2細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以1×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于24孔板中,每孔1 mL,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件如1.2.1.1。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)面積達(dá)到50%左右時(shí),棄去培養(yǎng)基,加入不同體積的過(guò)氧化氫和DMEM培養(yǎng)基,過(guò)氧化氫終濃度分別為(10、100、500、1000 μmol/L)。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔,以不加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基為空白對(duì)照,在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)基吸出,用PBS清洗3次,每孔加入1%的戊二醛溶液1 mL,以50 r/min的轉(zhuǎn)速在搖床振蕩固定20 min后,棄去戊二醛溶液,加入PBS溶液潤(rùn)洗2～3次。加入1 mL的0.02%的結(jié)晶紫溶液,50 r/min搖床振蕩染色30 min,用蒸餾水清洗至基本沒(méi)有顏色。然后加入80%的乙醇溶液將結(jié)晶紫溶解出來(lái),595 nm下酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，以細(xì)胞增殖抑制率確定最佳的H2O2濃度。細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算如公式(1)所示。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(空白對(duì)照OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照OD值]×100

式(1)

1.2.1.3 細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[24]中的方法略作修改,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-G2細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以1×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于24孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)條件如1.2.1.1,當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)面積達(dá)到50%左右時(shí),棄去培養(yǎng)基,加入一定量的過(guò)氧化氫、γ-萜品烯母液以及培養(yǎng)液,使得過(guò)氧化氫的濃度為100 μmol/L,γ-萜品烯的質(zhì)量濃度依次為0.500、0.200、0.100、0.050和0.025 mg/mL,陰性對(duì)照組只加入100 μmol/L的過(guò)氧化氫培養(yǎng)液,空白對(duì)照組加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件如1.2.1)中培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)基,用PBS 清洗兩遍,胰酶消化后,在4 ℃、3000 r/min條件下離心5 min,棄去上清液收集細(xì)胞,加入100 μL細(xì)胞裂解液(高效RIPA∶PMSF=100∶1)在冰上裂解30 min,在4 ℃、10000 r/min條件下離心5 min,收集細(xì)胞上清液,按總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(羥胺法)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒(比色法)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(可見(jiàn)光法)等的說(shuō)明檢測(cè)SOD、GSH-Px、CAT等的活性。

1.2.1.4 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量的測(cè)定 按1.2.1.3所述方法處理細(xì)胞,然后依照MDA測(cè)定試劑盒(TBA法)、GSH測(cè)定試劑盒(微板法)等的說(shuō)明測(cè)定MDA和GSH的含量。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)中[25-26]天然產(chǎn)物提取物體內(nèi)抗氧化劑量,本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三個(gè)濃度劑量組,分別為:高劑量200 mg/kg、中劑量100 mg/kg、低劑量50 mg/kg。將小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,空白組口服蒸餾水;藥物組進(jìn)行灌胃,連續(xù)21 d,給藥體積10 mL/kg。

1.2.2.2 小鼠血清、肝臟勻漿的制備 血清:小鼠眼眶取血后,4 ℃下放置約1 h,使血清充分析出,然后4 ℃下3000 r/min離心10 min,分離血清,在-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

肝組織勻漿:取血后,脫頸椎處死小鼠,取出肝臟,用預(yù)冷的生理鹽水洗去浮血,濾紙吸干后在冰浴中用預(yù)冷的PBS緩沖液機(jī)械勻漿(9 mL PBS,1 g肝臟組織),4 ℃下3000 r/min離心10 min。

1.2.2.3 抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 1.2.2.2中血清和肝組織勻漿的SOD、GSH-Px、CAT的活性以及GSH和MDA的含量利用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度 由圖1所示,細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨樣品液濃度的增加而下降。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,各濃度組樣品液的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p<0.05)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27-28],在類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中,Hep-G2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度之所以降低,是因?yàn)樗幬镒饔糜诩?xì)胞后,在細(xì)胞膜外部結(jié)合氧自由基阻止其進(jìn)入細(xì)胞,還能在細(xì)胞膜內(nèi)部與活性氧(ROS·)和過(guò)氧化自由基(ROO·)結(jié)合,從而防止還原型二氯熒光素(DCFH)被氧化成氧化型二氯熒光素(DCF),減少了帶有熒光的DCF的形成。因此,圖1結(jié)果可以說(shuō)明,γ-萜品烯能明顯降低細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,原因就是該物質(zhì)降低了細(xì)胞內(nèi)自由基或活性氧的水平,抑制了DCFH被氧化為DCF的反應(yīng),因而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低,從而起到了抗氧化作用。這種作用隨著γ-萜品烯質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),呈現(xiàn)出良好的劑量-作用關(guān)系。當(dāng)γ-萜品烯質(zhì)量濃度達(dá)到0.500 mg/mL時(shí),抗氧化效果達(dá)到最高。但是,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),ROS在細(xì)胞體內(nèi)緩慢積累,同一濃度處理下,熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而升高,這種變化趨勢(shì)也和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[29]。

圖1 不同濃度γ-萜品烯對(duì)Hep-G2細(xì)胞熒光強(qiáng)度影響Fig.1 Effects of different amounts of γ-terpinene on Hep-G2 cellular fluorescence intensity

2.1.2 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立 不同濃度的過(guò)氧化氫作用于Hep-G2細(xì)胞4 h后,細(xì)胞存活率如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)過(guò)氧化氫濃度為10、100 μmol/L時(shí),二者的細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。而當(dāng)濃度增加至500、1000 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率顯著下降(p<0.05),這與韓飛等[30]所報(bào)道的結(jié)果基本一致。在下一步實(shí)驗(yàn)中,選取100 μmol/L的過(guò)氧化氫誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激模型。

圖2 過(guò)氧化氫對(duì)Hep-G2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentration of H2O2 on survival rate of Hep-G2 cell 注:不同字母代表組間具有顯著性差異(p<0.05),圖3～圖4同。

2.1.3 細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT的活性 SOD是氧自由基的天然清除劑,廣泛存在于生物體的各種組織中,能夠消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),具有抗衰老的效果。由圖3A可知,在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,不同質(zhì)量濃度的γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,SOD的活性隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。在低濃度(0.025、0.050 mg/mL)處理組中,SOD的活性雖然較陰性對(duì)照略有上升,但是差異并不顯著(p>0.05)。而在高濃度(0.100、0.200、0.500 mg/mL)處理組中,T-SOD的活性均顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。但是,即使藥物濃度達(dá)到0.500 mg/mL,其SOD的活性仍然顯著低于空白對(duì)照(p<0.05)。說(shuō)明γ-萜品烯在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,可以在一定程度上保持T-SOD的活性。

圖3 γ-萜品烯對(duì)Hep-G2細(xì)胞幾種抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of γ-terpinene on antioxdases activity of Hep-G2 cell

GSH-Px也是體內(nèi)一種重要的過(guò)氧化物分解酶,可以將有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物。由圖3B可知,不同質(zhì)量濃度的γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,GSH-Px的活性隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。在各濃度處理組中,GSH-Px的活性均顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。但是,即使藥物濃度達(dá)到0.500 mg/mL,其GSH-Px的活性仍然顯著低于空白對(duì)照(p<0.05)。說(shuō)明γ-萜品烯在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,可以在一定程度上保持GSH-Px的活性。

CAT是一種酶類(lèi)清除劑,可以將過(guò)氧化氫分解成水和分子氧。CAT廣泛存在于動(dòng)植物的體內(nèi),能夠保護(hù)細(xì)胞免于過(guò)氧化氫的毒害,是生物防御體系中的關(guān)鍵酶。由圖3C可知,不同質(zhì)量濃度的γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,CAT的活性隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。在各濃度處理組中,CAT的活性均顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。但是,即使藥物濃度達(dá)到0.500 mg/mL時(shí),其CAT的活性仍然顯著低于空白對(duì)照(p<0.05)。說(shuō)明γ-萜品烯在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,可以在一定程度上保持CAT的活性。

2.1.4 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH的含量 MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,會(huì)引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的交聯(lián),從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。由圖4A可知,不同質(zhì)量濃度的γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,MDA的活性隨著藥物濃度的升高而降低。在各濃度處理組中,MDA的含量均顯著低于陰性對(duì)照(p<0.05)。但是,即使藥物濃度達(dá)到0.500 mg/mL時(shí),其MDA的活性仍然顯著高于空白對(duì)照(p<0.05)。說(shuō)明γ-萜品烯在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,可以在一定程度上抑制MDA的形成。

圖4 γ-萜品烯對(duì)Hep-G2細(xì)胞MDA、GSH含量的影響Fig.4 Effects of γ-terpinene on MDA and GSH content in Hep-G2 cell

GSH是一種低分子清除劑,是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽,具有清除低分子的作用,并且是GSH-Px和谷胱甘肽疏基轉(zhuǎn)移酶(GST)的底物,為這兩種酶分解氫過(guò)氧化物所必需,它還能夠穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷。由圖4B可知,不同質(zhì)量濃度的γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,GSH的含量隨著藥物濃度的升高而增加。在各濃度處理組中,GSH的含量均顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。但是,即使藥物濃度達(dá)到0.5 mg/mL,其GSH的含量仍然顯著低于空白對(duì)照(p<0.05)。說(shuō)明γ-萜品烯在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,可以在一定程度上延緩GSH的消耗。

綜合以上指標(biāo)的檢測(cè),總結(jié)γ-萜品烯在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用如下:活性氧(ROS·)是生物有氧代謝中的一種副產(chǎn)物,包括含氧自由基、過(guò)氧化物和氧離子等。ROS·的產(chǎn)生可以使細(xì)胞內(nèi)的各種氧化酶受到損傷從而迅速失活,GSH的含量也隨之降低直至耗竭。同時(shí),ROS·攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化形成MDA。過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中,細(xì)胞內(nèi)部抗氧化體系和體內(nèi)自由基的平衡被打破,大量ROS·的產(chǎn)生導(dǎo)致了細(xì)胞氧化性損傷。γ-萜品烯作用于Hep-G2細(xì)胞后,增強(qiáng)了細(xì)胞清除ROS的能力,細(xì)胞內(nèi)各種抗氧化酶的活性得到了一定程度上的恢復(fù),比如SOD對(duì)超氧陰離子的歧化作用和GSH-PX對(duì)過(guò)氧化氫的還原作用等均得到了增強(qiáng)。與此同時(shí),細(xì)胞生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用被有效抑制,MDA的生成量也因此下降。而在劉榮等[24]的實(shí)驗(yàn)中,山桃稠李果實(shí)花色苷在Hep-G2細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中起到的作用和γ-萜品烯剛好相反,該物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)可以提高熒光強(qiáng)度,降低幾種抗氧化酶的活性和GSH的含量,同時(shí)提高M(jìn)DA的含量,這是因?yàn)樯教页砝罟麑?shí)花色苷可以引起氧自由基和活性氧的增加。由此可見(jiàn),藥物在細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響,主要取決于對(duì)氧自由基和活性氧的調(diào)控。不過(guò),γ-萜品烯只能在一定程度上清除體內(nèi)的ROS·,并不能完全恢復(fù)由過(guò)氧化氫誘發(fā)的細(xì)胞損傷。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠血清和肝組織中抗氧化酶的活性 由表1可知,與空白組相比,高劑量的γ-萜品烯可以顯著提高小鼠血清和肝臟中SOD的活性(p<0.05)。中、低劑量組對(duì)SOD的影響并不明顯。

表1 γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝組織中T-SOD活性的影響Table 1 Effects of γ-terpinene on T-SOD activity of serum and liver in mice

不同劑量γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝臟中GSH-Px活性的影響如表2所示。在血清中,只有高劑量組可以顯著提高GSH-Px的活性(p<0.05)。在肝臟中,高、中劑量組均可以顯著提高GSH-Px的活性,且二者之間無(wú)顯著差異(p>0.05),低劑量組雖然也能提高GSH-Px活性,但與空白組相比并無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

表2 γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝組織中GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of γ-terpinene on GSH-Px activity of serum and liver in mice

從表3可以看出,與空白組相比,高、中劑量藥物組均能顯著提高血清和肝臟中CAT的活性(p<0.05),而低劑量組對(duì)CAT的活性并沒(méi)有顯著影響。

表3 γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝組織中CAT活性的影響Table 3 Effects of γ-terpinene on CAT activity of serum and liver in mice

2.2.2 小鼠血清和肝組織中MDA、GSH的含量 不同劑量γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝臟中MDA含量的影響如表4所示。在血清中,高、中劑量組均可以顯著降低MDA的水平(p<0.05)。而低劑量組對(duì)MDA的含量并沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響(p>0.05)，在肝臟中，高、中、低劑量組均可以顯著降低MDA水平(p<0.05)。

表4 γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝組織中MDA含量的影響Table 4 Effects of γ-terpinene on MDA content of serum and liver in mice

γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝臟中的GSH含量亦有影響。如表5所示,在血清中，高、中、低劑量組均可以顯著提升GSH的含量(p<0.05)。在肝臟中，高、中劑量均能顯著提高肝臟中GSH水平(p<0.05),其二者之間的作用效果差異并不顯著(p>0.05)。低劑量仍然沒(méi)有起到明顯作用。

表5 γ-萜品烯對(duì)小鼠血清和肝組織中GSH含量的影響Table 5 Effects of γ-terpinene on GSH content of serum and liver in mice

綜合以上指標(biāo)可以看出,γ-萜品烯在體內(nèi)顯示出了一定的抗氧化能力。在一定濃度范圍下,γ-萜品烯可以提高SOD、GSH-Px和CAT等幾種抗氧化酶的活性,同時(shí)提高GSH的含量、降低MDA的水平,這與其在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中的作用相似。高、中、低三個(gè)劑量組對(duì)抗氧化酶活性以及MDA和GSH含量的影響存在差異,與空白組相比,高劑量組對(duì)所有指標(biāo)均體現(xiàn)出了顯著的影響(p<0.05),而中、低劑量組則對(duì)部分指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。以上結(jié)果和文獻(xiàn)中[25-26]報(bào)道的一些天然產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化的作用一致,說(shuō)明對(duì)抗氧化酶、GSH、MDA等的水平產(chǎn)生影響,是體內(nèi)抗氧化作用的一種途徑。本章實(shí)驗(yàn)中,γ-萜品烯在細(xì)胞模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的作用相似,均體現(xiàn)出了一定的抗氧化能力,與前期化學(xué)方法評(píng)價(jià)相比,更具說(shuō)服力。

3 結(jié)論

熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果表明,γ-萜品烯可以降低細(xì)胞內(nèi)自由基或活性氧的水平,抑制DCFH被氧化為DCF的反應(yīng),從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低、起到抗氧化作用。在由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)建立的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中,γ-萜品烯可以保護(hù)SOD、GSH-Px和CAT等幾種抗氧化酶的活性,從而在一定程度上恢復(fù)由過(guò)氧化氫引發(fā)的細(xì)胞損傷,起到抗氧化作用;在體內(nèi)抗氧化能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),高劑量組和中劑量組的γ-萜品烯可以保護(hù)血清和肝臟中幾種抗氧化酶的活性,從而在體內(nèi)發(fā)揮一定的抗氧化作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)和本文研究結(jié)果,說(shuō)明γ-萜品烯不論在體內(nèi)還是體外都能發(fā)揮一定的抗氧化作用,具備成為天然抗氧化劑的潛力。