矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對H2O2誘導細胞氧化損傷的保護作用

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(吉林醫藥學院 基礎醫學院病原生物學教研室,吉林 132013)

當體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生超出機體自身的清除能力,會造成ROS大量累積,機體正常的氧化/還原平衡狀態遭到破壞,導致蛋白質、脂質、核酸等生物大分子物質氧化損傷和功能紊亂,影響機體正常代謝過程,這一系列異常應激狀態稱為氧化應激。天然植物中抗氧化活性成分常被用作食品抗氧化劑,這類天然抗氧化劑能夠協助機體抵抗ROS引起的氧化損傷,這一過程與調節抗氧化信號通路、激活Ⅱ相解毒酶以及上調內源性抗氧化物質有關[1]。研究表明,當細胞受到外源或內源氧化刺激時,產生的ROS會激活多條信號通路[2]。核轉錄相關因子2(Nrf2)是調控抗氧化應激相關通路的關鍵轉錄因子,正常生理狀態下,Nrf2與Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)以二聚體的形式存在于細胞質中,當細胞處于氧化應激狀態時,二者解離,Nrf2進入細胞核并與抗氧化反應元件(ARE)結合,參與某些細胞保護性蛋白的表達,如Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶類,從而保護細胞對抗氧化應激損傷[3-4]。

花青素又名花色素、花色苷,是一類具有抗氧化活性的水溶性天然化合物,廣泛存在于紫色和紅色的水果與蔬菜中,具有重要的生理功能和良好的開發利用前景[5-6]。花青素因其良好抗氧化活性且含量豐富,常被用作功能食品原料。花青素的苷元、糖苷配體種類較多,目前已鑒定出自然界中的花青素有550余種,蔬菜和水果中的矢車菊素占50%[7,8]。矢車菊素-3-O-葡糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,C3G)是最普遍和研究最多的花青素之一,對預防人類多種慢性病具有潛在作用[9]。矢車菊素可通過多種途徑清除自由基,并且其還原力及抗氧化能力優于其他花青素提取物。

本研究采用過氧化氫(H2O2)體外誘導人胚腎293(HEK-293)細胞損傷,建立HEK-293細胞氧化應激模型,基于細胞活力水平、ROS、丙二醛(MDA)水平考察C3G對細胞的保護作用,并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胚腎(HEK-293)細胞 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;矢車菊素-3-O-葡糖苷(≥ 98%) 中國藥品生物制品檢定所;DCFH-DA熒光染料 美國Sigma公司;DMEM培養基、PBS緩沖液、FBS胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素 美國Gibco公司;MTS試劑盒、PCR試劑盒 美國Promega公司;反轉錄試劑盒和SYBR染料 日本Takara公司;MDA、SOD、CAT、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗體KEAP1、NFE2L2、GAPDH、二抗 武漢博士德生物工程有限公司。

Synergy HT多功能酶標儀 美國BioTek公司;MiniBIS Pro凝膠成像系統 以色列DNR公司;SDS-PAGE電泳儀、轉膜儀、PCR儀 美國Bio-Rad公司;HF90二氧化碳培養箱 上海力申科學儀器有限公司;FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 采用含有10% FBS,1%青霉素-鏈霉素和1%非必需氨基酸的DMEM培養基培養HEK-293細胞,細胞接種后在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養24 h。

1.2.3 C3G對H2O2誘導損傷細胞活力的影響 試驗設三個組(6個平行/組),分別為對照組、H2O2損傷組和C3G保護組。接種細胞懸液密度為6.0×104個/mL,80 μL/孔,培養24 h;保護組加10 μL 1.25、5、20 μmol/L的C3G(終濃度),對照組和損傷組補充10 μL DMEM培養基,培養12 h;損傷組和保護組加入H2O210 μL/孔(終濃度0.4 mmol/L),對照組補充10 μL DMEM培養基,孵育6 h后檢測OD值,計算細胞活力[11]。

1.2.4 MTS法測定細胞活力 按1.2.2、1.2.3方法孵育完成的細胞置于96孔板中，每孔加入20 μL MTS[11],在37 ℃、5% CO2環境培養1 h,采用多功能酶標儀檢測490 nm處的吸光度(OD)值。以對照組為100%,計算公式如下:

細胞活力(%)=(A損傷組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100

1.2.5 細胞ROS測定 試驗分組同1.2.4(24孔板,3個平行/組),細胞接種密度為5.0×104個/孔,H2O2孵育結束后棄去培養基,清洗2次,加入含有10 μmol/L DCFH-DA的空白培養基37 ℃孵育20 min,PBS清洗3次后置于激光掃描共聚焦顯微鏡下收集熒光圖像,酶標儀讀取熒光值,激發/發射波長488/525 nm[12]。以對照組為1按如下公式計算相對ROS含量：

相對ROS含量=(F損傷組/保護組-F空白組)/(F對照組-F空白組)

1.2.6 細胞MDA水平測定 試驗分組同1.2.4(3個平行/組)，細胞以1.0×106個/孔的密度接種于6孔板，H2O2孵育結束后棄去培養基，各孔加入500 μL含有PMSF的裂解液冰浴裂解10 min，收集裂解液4 ℃下1000 r/min 離心5 min，收集上清液，根據試劑盒測定各組蛋白和MDA含量。

1.2.7 Western Blot法檢測細胞Nrf2和Keap1的蛋白表達 細胞懸液接種密度5×106個/10 cm培養皿,接種體積8 mL/培養皿,分組與加樣操作同1.2.4(加樣體積1 mL),PBS稀釋至2 mg/mL,加入loading buffer和DTT于沸水浴加熱5 min,上樣量20 μg/孔,12% SDS-PAGE膠電泳,然后將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;1∶1000比例稀釋一抗,4 ℃孵育過夜,TBST清洗后以1∶4000比例稀釋二抗,室溫孵育1 h[11];TBST清洗后ECL顯色,成像系統采集Nrf2,Keap1和GAPDH的蛋白圖像,采用密度分析軟件Image J對蛋白條帶圖像進行定量分析。

1.2.8 qRT-PCR法檢測細胞Nrf2和Keap1的mRNA表達 Trizol提取總RNA,測定RNA和DNA含量,將RNA含量調整一致,試劑盒去除DNA,然后反轉錄成cDNA,進行基因擴增,反應條件[13]:95 ℃、3 min,95 ℃、15 s(40 cycles),51.6 ℃(Nrf2)或58 ℃(Keap1)、20 s,72 ℃、30 s;在NCBI上下載Nrf2、Keap1和GAPDH全序列,采用DNAMAN找出基因片段,Primer Premier 5設計引物,Nrf2引物序列(F:3′-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5′,R:3′-CCATTC TTATTTCACCGACG-5′);Keap1引物序列(F:3′-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5′,(R:3′-TTAGTCA CCAGCGGGACG-5′);GAPDH引物序列(F:3′-CCTTCTACCACTACCCTA-5′,R:3′-TTTGACAC CGCACTACC-5′)。

1.3 數據處理

結果以“平均值±標準差”表示;通過One Way ANOVA法進行統計學分析確定各組間的差異顯著性,分析結果概率值小于0.05被認為差異顯著,具有統計學意義(不同字母表示p<0.05);SPSS 21.0軟件用于數據分析。

2 結果與分析

2.1 C3G對H2O2誘導損傷細胞活力的影響

HEK-293細胞是一種永生化的正常細胞,與癌細胞相比其具有更接近體內正常細胞的生理特性,能夠真實反映氧化應激狀態。H2O2是一種穩定的自由基來源,是建立氧化應激模型常用的誘導劑之一[14]。外源性H2O2可以穿過細胞膜,引起ROS的產生和積累,并結合細胞內金屬離子,造成DNA和線粒體損傷,甚至導致細胞死亡[15]。如圖1所示,0.4 mmol/L H2O2處理后細胞活力下降為53.8%±3.4%。與H2O2損傷組相比,1.25～20 μmol/L C3G保護組的細胞活力顯著增加(p<0.05),分別提高到63.2%±2.5%、69.4%±3.8%、77.2%±5.1%。結果表明1.25～20 μmol/L C3G孵育后能明顯提高氧化應激細胞活力,呈濃度依賴效應,C3G能抑制H2O2誘導的HEK-293細胞氧化損傷,對細胞有保護作用。相關研究表明,矢車菊素能抵抗過氧化氫自由基[16],Lee等[17]也通過H2O2誘導胰腺β-細胞氧化損傷,并且考察了C3G對氧化損傷細胞活力影響,結果表明C3G提高了損傷細胞的細胞活力,說明C3G對氧化應激誘導的胰腺β-細胞具有保護作用,這與本試驗結果是一致的。

圖1 C3G對HEK-293細胞的保護作用Fig.1 Protective effect of C3G on HEK-293 Cells注:圖中標注的不同字母表示組間差異顯著,p<0.05,圖2～圖5同。

2.2 C3G對HEK-293細胞ROS水平的影響

ROS如過氧化物、過氧化氫、羥基自由基等,能夠損傷核酸、蛋白質、脂質以及其它生物大分子。細胞調控ROS水平的能力能夠反映細胞所處的氧化還原狀態,ROS產生和消除的不平衡導致ROS大量累積,是導致細胞氧化應激的一個重要因素。如圖2A所示,對照組的綠色熒光強度較弱,說明對照組細胞內活性氧水平比較穩定,氧化還原處于平衡狀態;而經H2O2誘導的氧化損傷組其熒光強度增強;與H2O2損傷組相比,不同濃度C3G預處理的細胞熒光強度逐漸減弱。由圖2B可知,H2O2損傷組ROS相對量顯著提高,增加到近2倍(p<0.05),經過C3G預處理的細胞ROS相對含量隨濃度增大呈依賴性降低(p<0.05),但均高于對照組,可見C3G預處理可以顯著抑制由H2O2引起的ROS產生和累積,但無法使細胞恢復到未損傷前的正常狀態。相關研究表明花青素提取物能清除過量產生的ROS自由基，從而減輕由氨基甲酸乙酯誘導的HepG2細胞毒性作用[18]。本試驗發現,C3G預處理H2O2誘導的氧化應激損傷細胞后,其ROS水平呈濃度依賴性降低,說明H2O2誘導后細胞內產生大量自由基,ROS大量累積,C3G預處理后ROS相對含量顯著降低,這與Lee等[17]關于C3G能清除細胞內活性氧的試驗結果是一致的,說明C3G可以通過抑制ROS產生和累積從而抑制HEK-293細胞氧化應激損傷。還有類似研究表明,C3G通過靶向ROS,減輕棕櫚酸引起的內皮細胞功能紊亂,從而可以預防由氧化應激引起的幾種疾病[19]。這些研究都說明了C3G抑制HEK-293細胞氧化應激損傷的部分作用機制是通過清除/抑制細胞ROS而實現的。

圖2 C3G對HEK-293細胞ROS水平的影響Fig.2 Effects of C3G on the generation of ROS in HEK-293 cells.注:A:激光共聚焦顯微鏡采集的DCF熒光圖像;B:由DCFH-DA熒光探針計算出的ROS相對含量。

2.3 C3G對HEK-293細胞MDA水平的影響

細胞的MDA水平可以用來評價脂質過氧化損傷情況。一些體外研究表明花青素發揮抗氧化作用不僅依賴于清除自由基,而且與激活和改善細胞內生抗氧化系統有關[20]。如圖3所示,對照組MDA水平較低,約為(4.8±0.3) nmol/mg protein,說明正常細胞的氧化還原狀態比較穩定,脂質過氧化程度很低,但H2O2處理后MDA水平顯著提高到(16.6±1.0) nmol/mg protein(p<0.05),與此相比，不同濃度C3G預處理后細胞MDA水平顯著降低(p<0.05),并隨C3G濃度增大而呈濃度依賴性降低(13.6～8.7 nmol/mg protein)。有研究表明桑葚中提取的C3G能抑制脂質過氧化反應[17],同樣的,本研究發現C3G預處理后細胞MDA水平呈濃度依賴性降低,說明C3G能顯著降低過氧化氫自由基誘導的MDA升高,通過抑制細胞內脂質過氧化的產生和累積從而改善細胞氧化損傷。相關研究也同樣證明了C3G能夠通過降低MDA水平來保護細胞抗氧化應激[13,19,21]。

圖3 C3G對HEK-293細胞丙二醛(MDA)水平的影響Fig.3 Effects of C3G on MDA level in HEK-293 Cells

2.4 C3G對HEK-293細胞Nrf2/Keap 1通路的調節作用

食物中的外源抗氧化物質能抑制或減輕ROS引起的氧化損傷,在維持體內的氧化還原平衡中發揮顯著作用,目前,以信號通路為靶點的抗氧化應激研究是其機制研究中的熱點。如圖4A和4B所示,H2O2損傷組Nrf2的mRNA表達量大于對照組,但結果不顯著(p>0.05),而蛋白表達量顯著高于對照組(p<0.05);1.25～20 μmol/L C3G處理后,Nrf2的mRNA表達量顯著增大(p<0.05),并且呈濃度依賴性升高,同樣,蛋白表達量也呈現顯著的濃度依賴性升高趨勢。

圖4 C3G對HEK-293細胞Nrf2表達的影響Fig.4 Effects of C3G on protein and mRNA expressions of Nrf2 in HEK-293 Cells

如圖5A和5B所示,與對照組相比,H2O2損傷組Keap1的mRNA表達量略有降低,結果并不顯著(p>0.05),H2O2損傷組Keap1的蛋白表達量顯著低于對照組(p<0.05);1.25 μmol/L C3G處理后,Keap1的mRNA表達量下調不明顯,5和20 μmol/L C3G處理后,Keap1的mRNA表達量顯著低于H2O2損傷組(p<0.05),1.25～20 μmol/L C3G預處理后Keap1蛋白表達量較對照組顯著下調,但1.25與5 μmol/L組間的mRNA和蛋白表達量差異均不顯著(p<0.05)。有研究表明某些多酚類化合物和黃酮類化合物也可能激活一些細胞內信號通路,如Nrf2通路,調節抗氧化酶的表達和活性,以延長細胞防御反應[22-24]。通過本試驗發現,C3G呈濃度依賴性地上調HEK-293細胞中Nrf2的mRNA表達和蛋白表達,說明C3G可能是通過促進Nrf2表達從而提高抗氧化酶類的活力,進而抑制細胞氧化應激損傷。Speciale等[13]的體外試驗同樣表明,C3G能通過激活Nrf2通路來保護人體內皮細胞,從而激活抗氧化和解毒酶,對抗氧化應激。此外,本試驗發現C3G可以濃度依賴性地下調Keap1的mRNA表達和蛋白表達,說明C3G可能通過下調Keap1表達促進Nrf2與Keap1解離,使更多釋放的Nrf2進入細胞核與ARE結合啟動抗氧化相關基因表達,從而抵抗H2O2誘導的氧化應激損傷。相關研究還表明,桑葚花青素提取物有助于恢復HepG2細胞的氧化還原狀態,通過靶向MAPKs和Nrf2通路減輕過氧化氫誘導的細胞毒性[22],其部分作用機制與本試驗結果是一致的。

圖5 C3G對HEK-293細胞Keap1表達的影響Fig.5 Effects of C3G on protein and mRNA expressions of Keap1 in HEK-293 Cells

3 結論

本研究結果表明,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷具有細胞保護作用,并且其保護作用與促增殖無關,C3G可通過降低ROS和MDA水平抑制HEK-293細胞氧化損傷,其可能是通過激活Nrf2/Keap1信號通路、調節抗氧化相關基因實現的抗氧化應激作用。氧化應激是一個涉及多條信號通路及相關蛋白的復雜病理過程,所以除Nrf2/Keap1以外,是否還有其它通路參與了C3G抑制氧化應激過程還需進一步研究。本研究為C3G的抗氧化活性研究提供了一定參考,為植物源性食品的應用提供了一些理論依據。