兒童急性淋巴細胞白血病中SOCS3通過STAT3信號通路調節(jié)Treg細胞表達

黃玲玲，王寧玲，吳正玉，劉亢亢，儲金華，楊林海

近年來隨著對急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)發(fā)生機制的深入研究，國內外學者[1-2]發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127low調節(jié)性T細胞高表達導致的免疫抑制與ALL細胞惡性克隆相關，調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)與兒童ALL之間存在密切關系，控制ALL患者體內Treg細胞的數(shù)量和功能可以提高ALL患者的抗腫瘤免疫能力及白血病微小病變殘留的清除能力。細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)能夠通過抑制Janus蛋白質酪氨酸激酶/信號轉導因子和轉錄激活子3(janus protein tyrosine/singal transducer and activator of transcription 3，JAK/STAT3)信號的行為間接參與到調控T淋巴細胞分化、成熟的過程，在調控體內Treg細胞表達中起到關鍵作用[3-4]。該研究測定兒童ALL中SOCS3與Treg細胞表達水平的關系, 探討SOCS3在兒童ALL疾病狀態(tài)和危險度評估、腫瘤免疫以及靶向治療中的應用。

1 材料與方法

1.1病例資料研究對象：2015年1～12月在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科血液病區(qū)住院的新診斷ALL患兒。納入標準：符合細胞形態(tài)學、免疫分型、遺傳學及分子生物學診斷標準的ALL，入組年齡1個月～18歲，中位年齡5.8歲，排除以下情況：成熟B急性淋巴細胞白血病、混合表型的急性白血病、免疫缺陷性疾病、第二腫瘤、非初治的ALL。依據(jù)初治時疾病危險度將患兒分組，共分為低危(low risk, LR)、中危(moderate risk, MR)和高危(high risk, HR) 3組，化療方案采用中國兒童ALL多中心治療研究方案(急性淋巴細胞白血病-2015方案)，該化療方案包括三個階段，分別為誘導緩解化療、鞏固化療治療、維持化療治療。兒童ALL染色體核型異常并形成融合基因包括TEL-AML基因、BCR/ABL基因、POX基因、MLL基因等。最終確定入組ALL病例45例，其中女性患者22例，男性患者23例，患兒年齡為8個月～14歲，中位年齡為5.8歲，入組患兒的相關臨床特點見表1。同時設置正常對照組，正常對照組選擇13名健康兒童，其中女孩7例，男孩6例，正常對照組兒童年齡3～14歲，中位年齡5.8歲。兩組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。所有確診ALL的入組患兒和正常對照組健康兒童資料中均留存廢棄標本用于科學研究知情同意書，該知情同意書由其監(jiān)護人簽署。

表1 45例ALL患兒的臨床特點

1.2外周血單個核細胞和RNA的提取用無菌乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA) 抗凝管留取ALL患兒和正常兒童外周血3 ml，加入Ficoll分離液(天津生物科技有限公司)，按照說明提取外周血單個核細胞。按照TRIzol法(美國Invitrogen公司)提取RNA，提取后的RNA溶于10 μl DEPC水中，微量光度計測定所有RNA樣本A260/A280為1.8～2.0。

1.3熒光定量PCR反應以Oligo d(T)為引物(美國Invitrogen公司)，按照逆轉錄試劑(美國Themero Scientific 公司)說明書進行cDNA合成；按照SYBR-Green試劑(美國Themero Scientific公司)說明書進行熒光定量PCR反應。SOCS3前引物序列：5’-CAGCTCCAAGAGCGAGTACCA-3’；SOCS3后引物序列：5’-AGAAGCCGCTCTCCTGCAG-3；STAT3前引物序列：5’-AGGAGGAGGCATTCGGAAA-3’；STAT3后引物序列：5’-AGCGCCTGGGTCAGCTT-3’；內參基因GADPH前引物序列：5’-AATGGAAATCCCATCACCATCT-3’；GADPH后引物序列：5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’。

1.4流式細胞術測定Treg細胞水平采用全血直接計數(shù)法，以CD4-異硫氰酸熒光素(FITC) 設門，固定、破膜，別藻青蛋白(APC) 標記的FOXP3抗體染色30 min，檢測CD4+CD25+FOXP3+T淋巴細胞比例。

2 結果

2.1ALL患兒初診時SOCS3mRNA表達水平測定45例初診組ALL患兒初診時SOCS3 mRNA水平和正常對照組13例健康兒童的SOCS3 mRNA水平，測定數(shù)據(jù)顯示兩組SOCS3 mRNA相對表達量分別為(0.62±1.04)和(4.25±2.37)。該結果表明，初診組患兒在初診時SOCS3 mRNA的表達水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.759，P<0.05)。

2.2ALL患兒初診時STAT3mRNA表達水平測定45例初診組ALL患兒初診時和正常對照組13例正常兒童的STAT3 mRNA水平， STAT3 mRNA相對表達量分別為(3.11±1.17)和(0.87±0.14)，初診組患兒在初診時STAT3 mRNA表達水平是增高的，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.54，P<0.05)。

2.3ALL患兒初診時Treg細胞水平用流式細胞術檢測了初診組45例ALL患兒初診時和13例正常對照組兒童的Treg細胞表達水平，見圖1。對比數(shù)據(jù)結果可以看出，ALL患兒初診Treg細胞水平增高，與對照組差異有統(tǒng)計學意義(t=-9.163，P<0.05)，見表2。

圖1 初診組ALL患兒與正常對照組兒童Treg細胞表達水平

表2 初診組ALL患兒與正常對照組兒童Treg細胞表達水平

2.4ALL患兒初診時SOCS3、STAT3、Treg細胞表達相關性初診組ALL患兒STAT3的表達水平與Treg細胞表達水平呈正相關性(Treg：r=0.751，P<0.05)，而SOCS3的表達水平分別與STAT3、Treg細胞表達水平均呈負相關性(STAT3：r=-0.61，P<0.05； Treg：r=-0.558,P<0.05)，見圖2。

圖2 初診組ALL患兒STAT3、SOCS3、Treg細胞表達水平相關關系散點圖

3 討論

Treg細胞作為免疫抑制性細胞，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[5-6]，Treg細胞在血液系統(tǒng)腫瘤患者中表達水平增高、Treg細胞數(shù)量增加以及Treg細胞在腫瘤患者中功能增強都有利于腫瘤發(fā)展及生長，從而影響疾病的進展及進程。對于Treg細胞表達水平與兒童ALL之間存在的關系，以往的研究[1，7]表明在兒童ALL中存在Treg細胞表達水平增高的現(xiàn)象，本研究通過測定45例ALL患兒和正常對照組兒童Treg細胞表達水平，結果同樣證實在兒童ALL中Treg細胞表達水平增高，然而引起ALL患兒Treg細胞表達水平增高的機制目前尚不清楚。

隨著對Treg細胞表達調節(jié)機制的深入研究，STAT3在調節(jié)Treg細胞表達中起到了重要的作用[8]，STAT3與CD4+T細胞上白介素-6受體結合，上調叉頭蛋白-3的表達，促進了Treg細胞的活化。由此推論如果抑制了STAT3的表達，則可以直接或間接抑制Treg細胞的活化[9]。為探討在兒童ALL中STAT3與Treg細胞表達水平的關系，本研究同時測定了兒童ALL中STAT3表達水平，結果顯示兒童ALL中STAT3、Treg細胞水平明顯增高，提示在兒童ALL中STAT3的異常表達可能是導致Treg細胞水平增高的原因之一。

SOCS3是SOCS家族中的重要一員，是負性調控JAK/STAT3信號通路中重要的一種分子，在某些類型白血病中發(fā)現(xiàn)SOCS3存在低表達的現(xiàn)象，SOCS3低表達可導致STAT3的持續(xù)磷酸化[10-11]。課題組前期曾探討兒童急性淋巴細胞白血病SOCS3的表達水平與ALL臨床特點和ALL早期治療反應的相關性，相關數(shù)據(jù)可以證實：兒童ALL中存在SOCS3表達下調的現(xiàn)象，但SOCS3在疾病誘導緩解后能夠恢復正常表達[11]。為了探討在兒童ALL中SOCS3和STAT3兩者的關系，本研究同時測定了急ALL患兒中SOCS3的表達水平，結果表明SOCS3的表達水平在ALL兒童中明顯降低，提示在兒童ALL中SOCS3負性調節(jié)STAT3的表達，SOCS3的低表達導致STAT3的持續(xù)活化，從而引起Treg細胞的高表達。SOCS3對Treg細胞的調節(jié)作用，為白血病的免疫治療提供了新思路。

近年來SOCS3得到了學者們廣泛關注及深入研究，其作為可能的抑癌基因參與了各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移，參與了腫瘤的進展及病程[12-14]，課題組前期研究[11]揭示了SOCS3與兒童ALL發(fā)生、發(fā)展密切相關，SOCS3在ALL兒童中的低表達可以導致ALL中STAT3的持續(xù)活化，因此監(jiān)測ALL患者中SOCS3水平可以了解疾病狀態(tài)并可以評價危險度[10-11]。然而兒童ALL中SOCS3低表達的機制目前尚不清楚，SOCS3的低表達與兒童ALL長期無事件生存的關系以及STAT3的持續(xù)活化引起的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞表達增高的具體作用機制還有待進一步研究。有學者在關于肝癌的研究[15]表明SOCS3基因的甲基化可以引起SOCS3的低表達，接下來本研究計劃測定SOCS3基因甲基化水平，進一步探究SOCS3低表達的分子機制，同時繼續(xù)跟蹤隨訪入組研究對象的長期無事件生存情況。