HPLC-MS/MS法在白血病患者血漿維生素C水平測定中的臨床應用*

孫文利，王欣俞，田文君，李明花，陳佳琦，王 磊，張建平，劉紅星△

(1.河北燕達陸道培醫院，河北廊坊 065201；2.河北燕達醫院檢驗科，河北廊坊 065201；3.山東省立醫院臨床檢驗醫學部，山東濟南 250021)

維生素C又稱抗壞血酸，用于治療抗壞血病。人類自身不能合成維生素C，只能通過食用新鮮的蔬菜、水果及藥物等途徑獲得。維生素C是一種高效的抗氧化劑，大量文獻研究報道維生素C在抵御癌癥上起著重要的作用，其作用機制是維生素C可以阻斷致癌物N-亞硝基化合物合成，預防癌癥[1-5]；還可以通過清除氧自由基保護細胞免受損傷及對腫瘤細胞的殺傷作用[6]。維生素C能用來靶向并且殺滅癌癥干細胞[7]，增加人體食用維生素C可以降低人們肺癌風險[8]，高水平的維生素C可以有效抑制攜帶KRAS和BRAF突變基因的惡性結直腸癌[9]。此外，越來越多的證據表明維生素C可以促進造血干細胞死亡，用于治療白血病[10]。LIU等[11]研究發現，維生素C會增強地西他濱(5-aza-2′-deoxycytidine)的抗腫瘤作用，推測維生素C對某些惡性血液腫瘤治療有輔助效果；砷劑聯合維生素C治療急性早幼粒細胞白血病具有良好的臨床療效[12]；此外，在部分白血病患者中存在TET2基因突變，促進白血病干細胞分化為成熟的最終會死亡的血細胞，CIMMINO等[13]研究證明維生素C具有激活TET2的功能從而用于白血病的治療。未服用維生素C制劑的白血病患者嚴重缺乏維生素C(血清維生素C<11.4 μmol/L)[11]，因此，對于血液病患者，適當補充維生素C有一定治療意義。目前，測定血液病患者體內維生素C水平的文獻較少，且國內多采用高效液相色譜法測定維生素C水平[14-17]，本文建立了快速的、靈敏的、準確的超高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS/MS)法，用于測定血液病患者血漿中維生素C的水平，為臨床上白血病患者營養及治療上提供參考依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 主要儀器包括Qtrap 4000離子阱檢測器(美國AB公司)，島津HPLC 20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，色譜化學工作站(美國AB公司)，Vortex-Genie2 渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)，全自動高速冷凍離心機(Thermo Fisher)，電子天平(瑞士Sartorius公司)。試劑包括維生素C標準品(批號：6-EOD-174-1，規格：100 mg)，L-Ascorbic Acid-1-13C標準品(內標，批號：4-DXX-93-1，規格：5 mg)，均購自Toronto Research Chemicals Canada；甲醇為色譜純(Thermo Fisher)，水為超純水(屈臣氏蒸餾水)，偏磷酸(批號：K11871，規格：500 mg，含量99%)為分析純，購自山東西亞化學工業有限公司，甲酸為色譜純，乙酸銨為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜與質譜條件 (1)色譜條件。色譜柱XBridge?C18(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)(Waters，Made in Ireland)，流動相A：0.1%甲酸的甲醇溶液，流動相B：2 mMol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫(0.01～0.5 min，50%B→95%B；0.5～1 min，95%B保持0.5 min；1～1.5 min，95%B→50%B；1.5～2 min，50%B保持0.5 min)，流速為0.8 mL/min，柱溫60 ℃，進樣量10 μL。(2)質譜條件。采用電噴霧離子源(ESI)；以多重反應監測方式(MRM)掃描，負離子方式檢測；離子噴射電壓(IS)：4 500 V；離子源溫度(TEM)：450 ℃；源內氣體1(GS1，N2)壓力：55，氣體2(GS2，N2)壓力：55 V；Curtain gas：20；碰撞氣壓力：Medium；去簇電壓(DP)電壓：90V；碰撞能量(CE)20 V；入口電壓10 V；出口電壓15 V；用于定量分析離子對175.0→115.1(維生素C)，176.0→115.8(內標L-Ascorbic Acid-1-13C)。

1.2.2溶液制備 (1)精密稱取維生素C標準品10 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，搖勻，得到濃度為1mg/mL的維生素C儲備液，再用偏磷酸將其稀釋，配制成所需質量濃度的維生素C標準溶液，放置-20 ℃冰箱保存，備用。(2)精密稱取內標L-Ascorbic Acid-1-13C標準品5 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，搖勻，得到濃度為0.5 mg/mL的內標儲備液，再用偏磷酸將其稀釋，配制成質量濃度為10 μg/mL的內標溶液，備用。

1.2.3受試者選擇 隨機選取河北燕達陸道培醫院及山東省立醫院的白血病患者123例，男76例，女47例，年齡1～60歲。同時選取407名健康志愿者，男59例，女348例，年齡21～53歲。受試者均知情同意。

1.2.4血漿樣品處理

1.2.4.1標準曲線樣品處理 取20 μL相應質量濃度的標準溶液，加180 μL空白血漿，加入500 μL含有10 μg/mL內標溶液的10%偏磷酸溶液，渦旋混合1 min，13 000 r/min離心8 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

1.2.4.2待測血漿樣品處理 取200 μL待測血漿樣品，加入500 μL含有10 μg/mL內標溶液的10%偏磷酸溶液，渦旋混合1 min，13 000 r/min離心8 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

1.2.5方法學考察

1.2.5.1專屬性 取空白血漿200 μL，按“1.2.4.2”項下處理(不含內標)；在空白血漿中加入一定量的維生素C及內標L-Ascorbic Acid-1-13C的標準溶液，同樣按“1.2.4.2”項下處理；取患者血漿樣品，按同樣的方法處理，進樣分析，考察方法的專屬性。

1.2.5.2標準曲線及定量下線 取空白血漿180 μL，分別加入20 μL相應質量濃度的標準溶液，配制成相當于維生素C質量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的血漿樣品，按“1.2.4.1”項下條件處理，以維生素C與內標峰面積之比(Y)作縱坐標，以血漿維生素C濃度(X)為橫坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘進行線性方程回歸分析。

1.2.5.3精密度與回收率試驗 取空白血漿及維生素C標準溶液適量，配置成濃度為1、25、40 μg/mL的質量控制(QC)樣品，按“1.2.4.2”項下條件進行操作，每一濃度測定5個樣本分析，連續測定3 d，用當日的標準曲線測定QC樣品質量濃度，計算出回收率、日內及日間精密度。

1.2.5.4穩定性 隨機選取6例本院健康職工血漿樣本，分別考察維生素C在血漿樣品中放置室溫0、1、2、4、6 h的穩定性，按“1.2.4.2”項下條件進行操作。

1.2.5.5臨床應用 對選取的123例白血病患者及407名健康志愿者，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，按“1.2.4.2”項條件進行處理，進行樣本測定分析。同時取本院407名健康志愿者血漿，均未服用維生素C藥物，按同樣的方法進行處理測定。

1.3統計學處理 采用SPSS18.0對患者和健康志愿者兩組檢測結果進行統計學分析，采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1維生素C及內標的質譜圖 見圖1。

圖1 維生素C(A)、內標L-Ascorbic Acid-1-13C(B)二級掃描質譜圖

2.2方法學的考察

2.2.1專屬性 維生素C及內標L-Ascorbic Acid-1-13C的測定均不受內源性物質的干擾，專屬性良好。典型色譜圖見圖2。

注：A表示空白血漿；B表示空白血漿+維生素C+內標L-Ascorbic Acid-1-13C；C表示患者血漿樣品

圖2維生素C和L-Ascorbic Acid-1-13C色譜圖

2.2.2標準曲線及定量下線 回歸方程為Y=0.098 3X+0.002 78，r=0.994 2。結果表明，血漿中維生素C質量濃度在0.5～50.0 μg/mL內線性關系良好，其定量下線為0.1 μg/mL。

2.2.3精密度與回收率試驗 日內及日間相對標準偏差均小于5%，方法回收率在90%～110%，見表1。

表1 精密度及回收率結果

2.2.4穩定性 6例標本隨著在室溫放置時間的延長，血漿中維生素C的水平逐漸下降，4例標本在放置4 h時維生素C質量濃度已降至初始質量濃度80%，6 h時幾乎全部降至80%以下，甚至降至初始質量濃度的一半。見圖3。

圖3 維生素C血漿樣本在室溫的穩定性(n=6)

2.2.5臨床應用 測得患者及志愿者血漿中維生素C的濃度并分析其分布情況，見表2、圖4、5(比例分布)。80%白血病患者血漿中維生素C濃度在2 μg/mL以下，10%的患者血漿中維生素C濃度在2～<4 μg/mL，僅有10%的患者在4 μg/mL以上；而志愿者血漿中維生素C平均濃度為(8.8±3.0)μg/mL，92%均在4～15 μg/mL范圍內，兩組結果比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 維生素C的質量濃度測定結果(n=530)

圖4 血漿中維生素C濃度結果散點圖(n=530)

注：白血病患者體內維生素C濃度在4～15 μg/mL為正常，2～<4 μg/mL為水平不足，1～<2 μg/mL為缺乏，低于1 μg/mL為嚴重不足

圖5白血病患者血漿中維生素C濃度結果分布圖(n=123)

3 討 論

維生素C具有烯醇式己糖內酯立體結構，其烯醇式羥基極易解離出H+，具有有機酸的性質，遇到空氣中氧、熱、光、堿性物質及金屬離子存在時易氧化分解，為增加維生素C的穩定性，在溶液的配制及樣品前處理均采用10%的偏磷酸作為溶劑及沉淀劑[17]。目前關于人血漿中維生素C濃度的測定，大多采用HPLC法[14-17]，一般容易受到其他物質的干擾，且分析時間較長(>10 min)，本文建立了一種快速、靈敏、專屬性強的適合測定人體血漿中維生素C的HPLC-MS/MS方法，分析時間短(2.0 min)，在內標的選擇上，比較了L-Ascorbic Acid-1-13C和左旋多巴，綜合考慮保留時間、響應值后，選擇L-Ascorbic Acid-1-13C作為維生素C濃度測定內標物。實驗采用室溫放置24 h的血漿作為空白血漿，排除了內源性維生素C的干擾[18]，且通過實驗驗證空白血漿中維生素C水平低于方法的定量下線。為避免維生素C的快速降解，且為了滿足本院臨床標本的檢測，本文僅對血漿中維生素C在室溫條件下的穩定性進行了考察，維生素C濃度呈直線下降，建議臨床在采血后盡快送檢(2 h內)，最長不超過4 h，維生素C在其他條件下的穩定性還需進一步進行考察。該方法作為維生素C水平測定的分析方法，為患者在營養學評價及生理病理條件下提供臨床意義。

健康人血漿中維生素C濃度在4～15 μg/mL(正常范圍26～84 μmol/L)，2～<4 μg/mL為維生素C水平不足，低于2 μg/mL為維生素C缺乏，低于1 μg/mL時有可能引起壞血病[11,17,19-20]。測定的123份白血病患者樣本中，維生素C水平在2 μg/mL以下的占總數的80%，僅有12名患者血漿中維生素C水平在4 μg/mL以上，而健康志愿者血漿中維生素C濃度幾乎全在4～15 μg/mL，同時對結果偏低的健康志愿者進行了膳食調查，有志愿者處于哺乳或懷孕階段，推測這可能是導致維生素C濃度過低的原因之一，當生理狀況發生改變時應注意維生素C的變化，此外有兩名志愿者有8年以上的吸煙史，有研究稱吸煙會導致體內維生素C的減少[20-21]，所以應該減少吸煙。同時對530例樣本檢測結果做了散點圖(圖4)，圖中顯示志愿者維生素C濃度明顯高于白血病患者(P<0.01)，從而充分說明患者體內維生素C總體水平偏低，大多數白血病患者飲食上可能比較單一，導致其體內缺乏維生素C。

4 結 論

已有實驗證明，維生素C可以提高白血病患者的免疫力、誘導白血病細胞凋亡[12,22]，本實驗結果也為維生素C在白血病治療上的作用提供參考依據，因此對于白血病患者應適當多食用新鮮水果、蔬菜或維生素C制劑來補充維生素C，為其臨床治療提供幫助。