無創產前篩查陽性病例回顧性研究*

宋春林，陳淑芬，周 成，何云英，伍秋艷

(佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000)

染色體非整倍體疾病是胎兒畸形中較為常見的疾病，在美國發生率為1/160[1]，在中國的發生比例更是高達1/60[2]。常見的如21/18/13和性染色體三倍體或單倍體，特別是21三體綜合征(唐氏綜合征)發生比例大概為1/750，在高齡孕婦中發生概率更高。罹患胎兒會給家庭和社會帶來較重的經濟和精神負擔。臨床尚無有效治療措施，只能依靠產前早期檢查來避免。其中，介入性產前診斷準確度高，但有1%左右的流產或感染風險。傳統的血清學篩查假陽性和漏診率較高[3]。基于孕婦血漿中胎兒游離DNA高通量測序的無創產前檢測技術已廣泛應用于三大染色體(21/18/13)的三體檢測[4]。但根據介入產前診斷的核型結果，有文獻報道其假陽性較高，尤其是性染色體的陽性預測值偏低[5]。本研究回顧分析佛山地區20 811例無創產前檢測與介入性產前診斷的隨訪結果，探討該技術的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2015年4月至2018年6月期間在佛山市婦幼保健院產科門診就診經過遺傳咨詢和知情同意，自愿選擇無創產前檢測的孕婦。本研究經過倫理委員會批準。

1.2血漿分離 采用Cell free DNA BCT管(Streck抗凝管)收集孕婦外周抗凝全血10 mL，4 ℃1 600×g離心10 min分離血漿。要求無明顯溶血、凝血。

1.3胎兒游離DNA提取 采用磁珠法分離胎兒游離DNA，使用Qubit核酸定量分析儀檢測DNA濃度。濃度應在0.05～0.70 ng/mL內。否則通知孕婦重新采血。

1.4建庫與測序 采用EZ-PALO快速建庫法，并在ABI Step one plus擴增儀上進行QC檢測建庫濃度和質量，若QC不合格應重做。根據建庫濃度Pooling，混合在CN500測序平臺進行單端36+8(index)bp測序。

1.5數據分析 參照人類基因組hg19和各條染色體的比例均值與標準差，經GC矯正，計算各條染色體的Z值。21/18/13三大染色體Z值超過3為異常。性染色體通過XY的Z值散點圖判斷結果。其他染色體以Z值超過5為異常。計算胎兒DNA含量，要求在4%以上。

1.6介入性產前診斷 無創產前基因檢測異常的，給予遺傳咨詢，建議羊水穿刺后行G帶染色核型分析或熒光原位雜交(FISH)或基因芯片確診。其他常染色體異常的采用高通量測序染色體畸變檢測100 kb的微重復微缺失。

1.7胎盤嵌合體分析 胎盤娩出后立即分別在臍帶中段、臍帶根部、胎盤中心 、母親面胎盤中心、母親面胎盤邊緣五個地方各取兩個黃豆大的組織共10個樣本行高通量測序拷貝數變異(CNV)檢測。

1.8隨訪 對于無創產前基因檢測提示低風險的，定期電話隨訪至分娩后12周。對于高風險的，追蹤是否進行介入性產前診斷及結果。

2 結 果

2.1臨床資料分析 總共有20 811位孕婦在知情選擇下行無創產前基因檢測，年齡17～50周歲，平均31.40周歲，孕周12～27周,平均16.53周，高齡孕婦占39.2%(8 158/20 811)。輔助生殖技術孕婦占9.3%(1 935/20 811)。

2.2無創產前檢測結果 在這20 811例無創產前檢測結果中，提示異常的總共有314例(1.51%)。其中21/18/13三大染色體結果提示異常的有130例，性染色體結果提示異常的有111例(0.53%)，其他染色體結果提示異常的有73例(0.35%)。結果見表1。

2.3隨訪情況 在這314例無創產前檢測結果提示異常中，研究者做到了100%隨訪并提供遺傳咨詢，但有12例拒絕隨訪，有10例在隨訪時回答已胎死宮內或直接在外院引產但未做尸檢。另有61例拒絕進一步的介入產前診斷并繼續妊娠，大多數為性染色體異常和其他常染色體異常。

表1 20 811例無創產前檢測結果(n)

2.4進一步驗證 231例在知情同意下行羊水穿刺或臍血穿刺后進行染色體核型分析或高通量測序染色體畸變檢測拷貝數變異，部分加做了FISH檢測，極少數在外院以染色體微陣列芯片(CMA)分析或快速熒光擴增(Qf-PCR)驗證。其中136例的無創產前檢測結果與介入性產前診斷結果一致并選擇了引產，有1例行介入性產前診斷核型分析確診為21三體綜合征但孕婦選擇繼續妊娠并順產分娩，見圖1。而無創產前檢測與介入性產前診斷結果不一致的有94例，主要為性染色體和除三大染色體以外的常染色體異常。

圖1 無創21三體高風險行羊水穿刺培養染色體核型為47XY+21

2.5檢出率和陽性預測值分析 231人在知情同意下行介入性產前診斷，21/18/13三體陽性預測值分別為81.43%、76.92%、41.67%，性染色體陽性預測值為60.26%、其他常染色體陽性預測值為17.78%。其中21/18三體和性染色體異常的陽性預測值和檢出率較高。見表2。

表2 三體檢出率和陽性預測值(%)

2.6不一致的情況 26例21/18/13三大染色體結果不一致中，有10例在無創產前檢測結果直接提示了可能是嵌合體。經過胎盤取材用高通量測序的方法做拷貝數變異檢測鑒定為限制性胎盤嵌合體(CPM)。出現了2例18三體假陰性，核型分析結果該胎兒為18三體嵌合體，見圖2。性染色體結果不一致主要表現為ChrX+(Mat)和ChrX-，見圖3。

圖2 無創低風險行羊水穿刺培養染色體核型為47XY+18嵌合體

圖3 無創提示性染色體ChrX+(Mat)和ChrX-

3 討 論

先天性胎兒畸形最常見的是染色體非整倍體，患兒多生長發育遲緩、智力障礙、伴多發性結構畸形等[6]。臨床尚無有效治療措施，產前診斷是避免罹患胎兒出生的最有效措施。介入性產前診斷取得良好成果，近幾年畸形胎兒出生率有明顯降低，但文獻表明有1%左右的流產或感染風險[7]。介入性產前診斷需要較長的培養周期，且容易發生優勢生長，不利于嵌合體的檢測。而傳統的血清學篩查技術影響因素多，假陽性較高，大約為5%，且漏診率較高[8]，盡管劉春燕等[9]的研究認為血清學三聯篩查可在高齡孕婦中較有效地檢出胎兒唐氏綜合征，其綜合準確率只能達到70%左右。而且血清學篩查技術只能得出21三體和18三體的風險值，不能檢測13三體和性染色體等其他染色體異常。

無創產前檢測已廣泛應用于三大染色體(21/18/13)的三體檢測[10]。有文獻報道其準確率可以達到99%[11]。但其假陽性較高，尤其是性染色體的陽性預測值偏低[12]，其他常染色體則鮮見報道。隨著無創產前檢測技術大規模地應用于臨床，以核型分析為金標準，無創產前檢測結果的綜合陽性預測值較低，由此給臨床帶來的假陰性和假陽性問題不容忽視[5]。盡管很多檢測機構在進行無創產前檢測時已經為孕婦提供了一份保險。但如何降低假陽性、避免假陰性已經成為臨床亟待解決的問題。研究者將測序深度加大，采用基于貝瑞和康公司的無創產前檢測plus技術，可以檢測出三大染色體和性染色體共100種常見染色體異常。

本研究回顧分析了佛山地區20 811例無創產前檢測與介入性產前診斷的隨訪結果，檢出314例染色體核型異常(占1.51%)，我國的胎兒染色體異常的確遠遠高于美國的發生率。特別是二胎政策放開后，更多高齡孕婦，包括很多通過輔助生殖技術助孕的，也可能提高了胎兒染色體異常的比例。有231例在知情同意下下行介入性產前診斷。結果表明21/18/13三大染色體和性染色體的檢出率和陽性預測值均較高。高齡組占總檢測人數的39.2%，數據表明高齡孕婦傾向于選擇無創產前檢測技術。輔助生殖技術孕婦占9.3%，達到1 935人次，說明輔助生殖技術的孕婦偏向于選擇無創產前檢測技術。

對假陽性和假陰性分析。有10例在無創結果顯示可能為限制性胎盤嵌合體。一例羊水穿刺Fish檢測發現10%的21三體，核型為46XN，分娩后胎盤嵌合體分析，發現胎盤母體面為21三體，胎盤胎兒面則為46XY。限制性胎盤嵌合體除了可能導致假陽性，還可能導致假陰性。兩例無創結果低風險，但核型分析結果證實胎兒和胎盤均為18三體嵌合體。LEBO等[13]也發現了嵌合體導致的假陰性。研究者對部分病例做了胎盤嵌合體分析，發現經過細胞培養的染色體核型分析存在某個核型優勢生長的現象，與GRATI等[14]的發現一致，一例無創結果為Chr16+，高通量測序結果為CNV:47XN+16[35%]/46XN[65%]，核型在110個細胞發現一個細胞47XN+16。一例無創結果為ChrX-，介入性產前診斷高通量測序CNV結果為47XYY，但核型分析數了100個細胞才發現一個細胞是47XYY，而未經培養FISH檢測卻與CNV檢測結果一致。1例無創產前檢測提示性染色體異常ChrX-，CNV顯示為47XYY，FISH羊水分析提示胎兒為47XYY[55%]46XY[45%]的嵌合體，然而核型結果為正常。1例無創結果為ChrX+(Y)，FISH結果為[99%]47XXY，核型為47XXY[54]/46XY[46]，CNV為47XXY[50%]/46XY[50%]。說明隨著各種檢測技術的出現，特別是在嵌合體分析上，核型分析結果不應作為唯一的參考。

傳統的核型分析只能檢測出大于10 Mb的異常。而微重復微缺失檢測可以檢測到100 kb的畸變[15]。1例無創產前檢測結果提示Chr6+，但核型分析結果正常，而CNV結果6p12.1q13區域小片段的重復。研究者發現2例孕婦分別在21q22.3和21q22.2有3Mb的微重復導致胎兒無創產前檢測結果為21三體高風險的假陽性結果。1例無創結果為18三體但臍血穿刺核型結果為46XN，der(9)t(9；18)(p22；q11.2)，母親平衡易位46，t(9；18)(p22；q11.2)。1例無創產前檢測結果為ChrX+Y(Mat)，羊水FISH和核型結果正常，孕婦核型為47XXX。說明孕婦染色體異常是無創和介入結果不一致的主要因素。無創產前檢測在雙胎應用的局限性以往也有報道[16]。如何消除這些因素的影響，提高無創產前檢測的準確率和陽性預測值是下一步要考慮的。如整合母體血漿測序和母體白細胞測序來提高其準確度[17]。此外，由于X染色體含有較多的GC堿基和失活現象以及與Y染色體標記序列的相似性影響了性染色體的檢測準確性也是值得注意的[18]。

4 結 論

本研究表明無創基因產前檢測在21/18/13染色體檢測中有較高的陽性預測值，且可以發現其他常染色體的異常，該技術已被廣大孕婦特別是通過輔助生殖技術助孕的孕婦接受。部分以核型分析為標準判斷無創產前檢測結果為假陽性的病例，通過其他如FISH、CMA、CNV新技術檢測可能發現胎兒為嵌合體或染色體微重復微缺失，應予以高度重視。但無創產前檢測也存在一定的局限性，在低比例嵌合體的檢測可能受到影響，也受孕婦染色體異常或孕婦腫瘤等因素的影響。