外周血miR-15a、miR-16檢測在獻血者早期乙型肝炎病毒感染篩查中意義

韓金玉

(山東省菏澤市中心血站，山東菏澤 274003)

輸血是外科手術、大面積燒傷搶救等治療中非常重要的臨床手段，但同時輸血也是乙型肝炎病毒(HBV)感染的主要途徑之一。因此，輸血前的血液篩查和檢測對保障血液和相關血液制品的安全具有十分重要的意義[1]。目前，國外普遍將乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)作為血液篩查指標[2-3]。之前，我國由于檢測技術受限，各地采供血機構主要采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行血液篩查。有研究顯示，HBsAg陰性但HBV-DNA陽性的HBV感染是我國主要的經血傳播疾病隱患[4]。近幾年，隨著我國核酸檢測(NAT)技術的發展，一些大型采供血機構逐漸采取NAT作為主要的血液篩查手段，縮短了ELISA的窗口期，提高了隱匿性HBV感染的檢出率[5]。但NAT在預防輸血傳染中的作用不僅取決于病原體窗口期的長短以及病毒拷貝速度，在很大程度上也取決于獻血人群中的新感染率以及血樣混合數量，當病毒載量太高或病毒發生變異時，都會造成HBV的漏檢。而且有相關研究表明，當外周血中HBsAb大量存在時，也會抑制HBV DNA的復制，從而導致HBV漏檢[6]；另外，NAT要求很高，成本也非常昂貴。因此，尋找新的檢測方法一直是臨床關注的重點。近幾年，微小RNA在多種疾病診斷和治療領域表現出巨大的潛力，包括在肝臟感染性疾病方面也成為研究熱點。有研究顯示，miRNA-15a(miR-15a)和mi-R16在HBV感染者中表達下調[7]，本項研究通過對核酸篩查不合格的獻血者進行隨訪追蹤，探討miR-15a和miR-16作為HBV感染早期診斷標志物和對獻血者進行HBV篩查的可行性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2018年1月本中心血站的無償獻血血液樣本156份。所有獻血者獻血前均經乙型肝炎金標試紙條和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)快速檢測篩查合格。其中有49份血液樣本常規ELISA雙試劑篩查HBsAg呈陽性而核酸HBV檢測呈陰性，作為E單陽組；54份血液樣本ELISA雙試劑篩查和NAT均為陽性，作為EN雙陽組；其余63份血液樣本經ELISA雙試劑篩查和NAT均為陰性，作為正常組。對血液樣本來源進行追溯后，發現E單陽組和EN雙陽組血漿標本的相應獻血者均為無明顯癥狀的輕度早期感染者。3組獻血者的一般臨床資料基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 獻血者的一般臨床資料分析

注：BMI表示體質量指數；SBP表示收縮壓；DBP表示舒張壓

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 5810R型臺式冷凍離心機以及移液器為德國Eppendorf公司產品；5 CFX-96-C1000 real-time PCR儀為美國Bio-Rad公司產品；BIOBASE2000全自動酶免分析儀，購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；Procleix TIGRIS System 全自動核酸檢測儀器，購自美國諾華公司；CobasS201核酸檢測系統，購自瑞士羅氏公司；Reflotron生化分析儀，購自瑞士羅氏公司；Roche Modular E170 全自動電化學發光免疫分析儀，購自瑞士羅氏公司；EDTA抗凝管為法國Becton Dickinson公司產品。

1.2.2主要試劑 HBsAg診斷試劑盒，購自廣州萬孚生物技術股份有限公司；Biomerieux HBsAg診斷試劑盒，購自法國梅里埃生物公司；Cobas TaqScreen MPX test NTA試劑盒，購自瑞士羅氏公司；乙型肝炎金標試紙條，購自藍十字生物藥業有限公司；Ambion RNA提取分離試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒、mirVanaTMPARISTM Kit，購自Takara公司；(6)焦碳酸二乙酯(DEPC)為美國Sigma公司產品。

1.3方法

1.3.1血液樣本采集 采血后取5 mL血液樣本用于常規血清學檢測；另外取5 mL血液樣本置于EDTA抗凝管中，離心，用于NAT。

1.3.2ELISA 分別采用新創和Biomerieux兩種試劑對血液樣本進行檢測，按照試劑盒說本書的操作步驟進行。灰區閾值設為待測物信號/臨界值(S/CO)：0.9，若雙試劑檢測S/CO≥0.9，則判定為HBsAg檢測陽性，血液樣本不合格。

1.3.3NAT 按照儀器和試劑使用說明進行操作。(1)樣本制備：通過目標捕獲試劑中的特異性靶標寡核苷酸捕獲探針，用磁珠吸附法從樣本中特異性地分離出HBV核酸分子；(2)轉錄介導擴增；(3)雜交保護檢測擴增產物；(4)聯合檢測驗收：待測物S/CO<1.00且內參在內參臨界值>650 000(RLU)范圍內則判斷為無反應；待測物S/CO≥1.00且內參≤650 000 RLU則判斷為有反應；內參<650 000 RLU或待測物S/CO<1.00且內參<內參臨界值則判斷為檢測無效。

1.3.4血漿miRNA提取 (1)向200 μL血液樣本中加入預冷的MZ裂解液，振蕩混勻，靜置5～10 min；(2)12 000 r/min離心，取上清，置于無RNase的EP管中備用；(3)加入200 μL氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；(4)12 000 r/min離心，取下層無色水相于無RNase的EP管中；(5)加入500 μL異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；(6)12 000 r/min離心，棄上清；(7)加入1 mL 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 r/min離心，棄上清；(8)將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；(9)加入20 μL DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃保存備用。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。

1.3.5RNA反轉錄 根據試劑盒說明書操作進行，將cDNA保存于-20 ℃備用。

1.3.6實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 將25 μL反應體系(12.5 μL SYBR Premix Taq+2 μL引物+2 μL模板+8.5 μL雙蒸水)置于37 ℃恒溫水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去離子水至100 μL，各反應孔取2 μL進行PCR。冰浴中配制25 μL PCR反應體系，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，重復循環45次。選擇β-actin作為內參。引物序列如下，miR-15a上游：5′-TGG CGA TGG CAG TGT CTT AG-3′，下游：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；miR-16上游：5′-CAG CTT TGA GGT TCG TGT TTG T-3′；下游：5′-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3′。

2 結 果

2.13組獻血者的血型信息 3組獻血者血型均為RH(+)，ABO血型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 3組輸血者血型分布[n(%)]

2.23組獻血者血漿miR-15a、-16的表達情況 采用qRT-PCR法檢測3組血液樣本中miR-15a和miR-16的表達情況，結果顯示，相較于正常組樣本，E單陽組和EN雙陽組血液樣本miR-15a和miR-16表達均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。且EN雙陽組血液樣本miR-15a和miR-16表達下調較E單陽組更為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組輸血者血漿miR-15a、miR-16表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05；與E單陽組比較，#P<0.05

2.3miR-15a、-16與HBV DNA拷貝數的相關性 通過分析EN雙陽組無償獻血者血漿中的HBV DNA拷貝數，發現miR-15a和miR-16與相應的HBV DNA拷貝數呈負相關性(r分別為-0.725、-0.866，P<0.05)。見表4、圖1。

表4 miR-15a、miR-16與HBV DNA拷貝數的相關性

圖1 miR-15a、miR-16與HBV DNA拷貝數的相關性

3 討 論

輸血是HBV感染的主要途徑之一，是全球范圍內普遍關注的公共衛生問題。我國屬于HBV感染大國，每年大約有超過8萬人死于HBV感染所致的各種疾病，因此，保證輸血安全，提高HBV檢測水平是我國亟須解決的重要問題[8]。自1993年國家衛生部頒布《血站基本標準》以來，所有獻血者的血液樣本必須經過ELISA雙試劑篩查方法，從而很大程度上提高了血液和血液制品的安全性[9]。但是ELISA篩查存在一定的窗口期，外界因素易導致漏檢風險。而NAT不僅可以將HBV的窗口期縮短為20 d，而且操作簡單，易于自動化，準確率較高[10-11]。有研究顯示，90%以上的HBV感染危險性來自于窗口期獻血者提供的血液樣本[12]。因此，為了保證輸血者的用血安全，推廣新的病毒檢測技術勢在必行。2010年，我國議政工作會議確立了北京、上海、廣州等15所大型采供血機構作為NAT首批試點單位，建議可選擇1種ELISA試劑盒聯合NAT，大大縮短了HBV病毒檢測的窗口期，提高了病毒的檢出率[13]。雖然NAT準確性提高，但是易受到外界環境和服用藥物的干擾，若病毒DNA合成受到抑制，則會影響NAT的表現，因此，ELISA與NAT是互補的關系，NAT不能完全替代ELISA法[14]。但是這種檢測方案仍然存在一定的漏檢率，主要是由于HBV窗口期的長短，窗口期期間的病毒拷貝速度和拷貝數，獻血人群中的新感染率以及多少血樣混合，都會影響到NAT的準確性；而且檢測程序繁瑣，工作量重，因此，探索新的檢測方法和指標一直是輸血安全領域研究的重點。

miRNAs是真核生物基因中一類非編碼的負性調控RNA，可以通過與靶基因3′-非編碼區結合抑制RNA轉錄[15]。目前，關于miRNAs與多種疾病之間的關系研究已經成為全球醫學界的熱點，但是國內外在關于miRNAs是否也參與了HBV DNA的復制以及哪些靶基因可能作為HBV DNA陽性診斷的候選標志物方面研究尚少。有學者通過生物信息學和基因芯片技術，初選HBV攜帶者與健康人群具有表達差異性的miRNA譜，包括miR-15a、miR-16等多種基因呈低表達，從而證實大量miRNAs參與肝臟感染性疾病的發生[16]。但是，目前絕大多數關于肝炎病毒感染者miRNAs的研究都是集中在肝臟組織和細胞中，在實際操作中，肝組織獲取受限，因此，探討外周血miRNAs與HBV感染的關系在獻血者篩查中具有更大的臨床意義。miR-15a、miR-16是位于同一個基因簇上并是由同一個轉錄本轉錄生成的miRNA。有研究顯示，HBV編碼蛋白HBX通過阻斷c-myc的表達，可以抑制miR-15a和miR-16啟動子活性，從而下調miR-15a和miR-16的表達[16]。不僅如此，還有學者通過相關研究證實，HBx在基因方面同樣可以調控miR-15a、miR-16的表達水平[17]。因此，筆者希望通過本項研究探討采用血漿miR-15a和miR-16作為獻血者HBV感染診斷標志物的可行性。結果顯示，相較于正常組樣本，E單陽組和EN雙陽組血液樣本miR-15a和miR-16表達均明顯下調，而且EN雙陽組血液樣本miR-15a和miR-16表達下調較E單陽組更為明顯。經Pearson相關性分析，miR-15a和miR-16與EN雙陽性患者的HBV DNA拷貝數呈負相關，說明血漿miR-15a和miR-16表達下調與HBV感染以及復制活動密切相關，且HBV DNA拷貝數越高，血漿miR-15a和miR-16表達水平越低。

4 結 論

miRNA-15a、miRNA-16相對表達水平不僅與HBV早期感染密切相關，而且可以反映病毒的復制情況，在實際操作中，可以根據獻血者體內HBV的復制情況判斷其HBV的活動期，同時，也為疾病的轉歸及治療提供一定的指導意義。但是，需要指出的是，雖然miRNA-15a、miRNA-16大大提高了HBV的檢出率，但是鑒于miRNAs從提取條件到檢測結果的成本可能較高，在目前的實際篩查工作中應用價值還有待進一步探討。