病毒性心肌炎患兒血清miR-133及miR-155水平的表達及臨床意義

鄧國清，魯利群，楊欣，賀靜，王旭，黃莉

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由親心肌細胞病毒感染引起的心肌細胞炎性反應，常見病毒包括柯薩奇B組病毒、巨細胞病毒及腸病毒等的感染均可導致VMC[1]。VMC患兒臨床表現不一，嚴重時可引起心力衰竭、心源性休克等并發癥，危及患兒生命[2]。微小RNA(micro RNAs，miRNA)是一類小的內源性非編碼RNA，長度18～25個核苷酸，miRNA可以通過與信使RNA(mRNAs)結合以阻止蛋白質翻譯，并在轉錄或轉錄后下調基因表達，其在多種生物過程中發揮重要作用，如細胞增殖分化、炎性反應、腫瘤、免疫等病理生理過程的調控[3]。近年來有研究表明，某些miRNA的異常表達，如miR-133、miR-155等，與心肌炎、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關[4]，檢測患者循環血中miRNA表達水平有助于對疾病嚴重程度的判斷以及治療方式的選擇[5-6]。miR-133定位于人類第6號染色體上，是一個多功能miRNA；miR-155定位于人染色體21q21，其由B細胞整合族第3個外顯因子的高度保守區域編碼而成。本研究通過檢測VMC患兒血清中miR-133、miR-155的表達水平，并分析兩者與VMC患兒心肌損傷、炎性因子及免疫功能等指標的相關性，以初步探討其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月—2018年6月成都醫學院第一附屬醫院兒科收治的急性期VMC患兒97例作為病例組，根據左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnI)結果，將病例組分為輕度VMC亞組和重度VMC亞組，其中輕度VMC亞組(LVEF≥50%，cTnI≤0.1 ng/ml)56例，男31例，女 25例；年齡1～12(6.25±1.18)歲；病程2～15(8.21±5.10)d；誘因：上呼吸道感染32例，腸道感染14例，原因不明10例；臨床癥狀：乏力27例，心悸16例，多汗13例；合并心力衰竭2例，合并嚴重心律失常1例。重度VMC亞組(LVEF<50%，cTnI>0.1 ng/ml)41例，男25例，女16例；年齡11個月～11歲(6.11±1.26)歲；病程2～17(9.13±4.80)d；誘因：上呼吸道感染23例，腸道感染11例，原因不明7例；臨床癥狀：乏力21例，心悸11例，多汗9例；合并心力衰竭2例，合并嚴重心律失常4例。另選取同期于醫院進行健康體檢的健康兒童40例作為健康對照組，其中男24例，女16例，年齡11個月～12歲。3組兒童的性別、年齡等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準通過，全部患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①所有患兒均符合中華醫學會制定的VMC診斷標準[7]，包括存在心功能不全、心源性休克，影像學存在心臟擴大、異常的心電圖改變，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)或cTnI升高，病原學檢查呈陽性；②患兒年齡≤12歲。(2)排除標準：①由先天性心臟病、風濕性心肌炎及代謝性疾病導致的心肌損害患兒；②合并肝腎等系統疾病患兒；③既往有VMC病史或家族史的患兒。

1.3 觀測指標與方法 分別于VMC患兒入院次日以及健康對照組兒童健康體檢時抽取受試兒童晨起空腹靜脈血5 ml待測。

1.3.1 免疫指標檢測：上述血樣2 ml置于EDTA抗凝管中，采用流式細胞儀(美國BD公司)檢測血漿CD4+、CD8+水平，并計算CD4+/CD8+值。

1.3.2 心肌損傷與炎性因子指標檢測：上述血樣3 ml室溫下靜置0.5 h后，離心取上清液，部分置于-20℃冰箱保存待檢。采用酶聯免疫吸附法(試劑盒購自北京北方免疫試劑研究所)檢測血清CK-MB、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、白介素-21(IL-21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteine aspartate proteolytic enzyme，Caspase-3)、可溶性凋亡相關因子配體(soluble apoptosis-related factor ligand，sFasL)水平，采用電化學發光法(試劑盒購自美國Spectral Diagnostics公司)檢測血清cTnI水平，以上操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 血清miR-133與miR-155表達水平檢測：余部分血清置于EP管中，保存于-80℃冰箱，應用miRNeasy Serum試劑盒(德國QIAGEN公司)提取血清中總RNA，采用紫外分光光度計鑒定RNA提純液純度后，將樣本保存于-80℃冰箱。應用熒光實時定量PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)在熒光定量PCR儀器(ABI 7000)上進行PCR反應。miR-133特異性正向引物序列：5'-TTGGTCCCCTTCAACCAGCTGT-3'，miR-155正向引物序列：5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3'，內參基因U6上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，通用的下游引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。反應體系： SYBR Green Mix 10 μl， cDNA模板2 μl，無RNA酶水4 μl，引物2 μl。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，每個樣本重復3次。應用相對定量法對結果進行分析，以2-ΔΔCt法計算血清miR-133與miR-155的相對表達量。

2 結 果

2.1 免疫功能、心肌損傷、炎性因子指標比較 與健康對照組比較，重度VMC亞組患兒CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-17、IL-21水平明顯升高，而血漿CD4+、CD4+/CD8+、IL-10明顯降低(P<0.05)，輕度VMC亞組患兒CD8+、CK-MB、 sFasL、Caspase-3、 IL-17、IL-21水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與輕度VMC亞組患兒比較，重度VMC亞組患兒CK-MB、cTnI、sFasL水平明顯升高，而CD4+水平明顯降低(P<0.05)；余指標3組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 血清miR-133和miR-155表達水平比較 與健康對照組比較，重度VMC亞組、輕度VMC亞組血清miR-133表達水平明顯降低，miR-155表達水平明顯升高(P<0.05)；與輕度VMC亞組患兒比較，重度VMC亞組患兒血清miR-133表達水平明顯降低，miR-155表達水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清miR-133和miR-155表達水平比較

2.3 血清miR-133、miR-155的表達與各指標的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，VMC患兒血清miR-133的表達與CD4+/CD8+呈正相關，與CK-MB、cTnI呈負相關(P<0.01)，與CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21無明顯相關性(P>0.05)；miR-155的表達與CD4+/CD8+呈負相關，與CK-MB、cTnI呈正相關(P<0.05)，與CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21無明顯相關性(P>0.05)，見表3。

表1 各組心肌損傷、炎性因子及免疫功能指標比較

表3 VMC患兒血清miR-133、miR-155的表達

3 討 論

血清中生物標志物的檢測是診斷心血管疾病的重要手段。近年來研究表明，miRNA參與了心血管疾病的發生、發展，循環中的miRNA具有靈敏度高、穩定、序列保守等優點，是一種可應用于心血管疾病診斷和預后評估的生物標志物[8]。VMC患兒血清中存在多種miRNA異常表達的現象，如在心力衰竭患者中，miR-133可以抑制ERG基因中 mRNA和蛋白質水平的表達，調節ERG編碼的鉀離子通道的表達，抑制病理性QT間期延長，從而可以抑制心肌的電生理重塑，進而發揮保護性作用[9-10]。有研究表明，VMC患兒血清miR-133表達調控功能失常，患兒易發生惡性心律失常及心功能下降[11]。miR-155在多種心血管疾病中均存在異常表達的現象，如在急性心肌梗死動物模型中，活化巨噬細胞的外泌體中miR-155的表達增加，富含miR-155的外泌體可以抑制成纖維細胞增殖并促進成纖維細胞炎性反應，而敲除miR-155可以明顯降低急性心肌梗死后心臟破裂的發生率[12]。此外，在VMC大鼠中，血清miR-155表達上調，而在敲除miR-155后，心肌細胞的損傷及炎性反應減輕，心臟功能失調也明顯減輕[13]。上述研究表明miR-133、miR-155的表達可能與VMC的發生、發展存在一定關聯。

本結果顯示， VMC患兒與健康對照組間CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21水平有明顯差異，表明機體的免疫功能、心肌損傷、炎性因子的異常與VMC的發生、發展關系密切。當發生VMC時，患兒體內的單核巨噬細胞、T淋巴細胞介導的細胞免疫及IL-10、IL-17、IL-21等細胞因子可以形成復雜的炎性反應調控網絡，其參與了VMC過程中炎性反應的發生發展[14]。另外，患兒一旦發生VMC，病毒感染將促使單核細胞等免疫細胞釋放大量細胞因子，從而可以促進心肌細胞表面CD54表達，進而造成淋巴細胞黏附及氧自由基介導的損傷。

本研究中，VMC患兒血清miR-155表達水平明顯高于健康對照組，且重度VMC患兒血清miR-155表達水平明顯高于輕度VMC患兒，結果表明VMC患兒血清miR-155表達水平上調，其表達水平上調程度與疾病的嚴重程度有關。目前VMC患兒血清miR-155水平上調機制尚不清楚，可能與炎性反應微環境中某些物質通過激活促炎細胞因子的產生有關。miR-155表達上調后可影響免疫細胞的功能，其可促進巨噬細胞向M2型極化，從而可以發揮抑制免疫的功能。有研究表明，VMC期間的心臟損傷不是由病毒對心肌細胞的直接細胞毒作用引起，而是通過誘導免疫應答對心肌細胞進行損傷[15-16]。本研究中進一步分析了VMC患兒血清miR-155與各指標間的相關性，結果顯示，VMC患兒血清miR-155的表達與CD4+/CD8+呈負相關。miR-155可能通過抑制免疫細胞如Treg、Th17細胞的活化，影響IL-4、IL-10等細胞因子的分泌，從而發揮免疫抑制的作用。另外，miR-155的表達與CK-MB、cTnI呈正相關，表明miR-155的表達與患者心功能損傷的嚴重程度有關，其有可能成為評價心肌損傷嚴重程度的指標。國內學者亦報道VMC患兒外周血中高表達miR-155能夠造成心肌細胞損傷及凋亡[17]。

miR-133特異性表達于心肌與骨骼肌中，包括miR-133a和miR-133b等2種類型，其參與了調控心肌細胞的分化、增生、肥大及凋亡，并能影響心肌細胞鈣離子通道的功能，維持正常心肌細胞動作電位復極化[18]。本研究中，VMC組患兒血清miR-133表達水平明顯低于健康對照組兒童，且重度VMC亞組患兒血清miR-133表達水平明顯低于輕度VMC亞組，表明VMC患兒血清miR-133表達水平下降，且其表達水平下降程度與疾病的病情嚴重程度有關。分析其可能原因為當患兒發生VMC時，肌細胞分化的關鍵因子，如肌細胞增強因子-2、肌原性分化因子-1等減少，從而導致以上因子調控miR-133的轉錄作用下降，進而使得miR-133表達水平下降[19]。另外，當患兒發生VMC時，轉錄因子CASP9的表達下降，也可導致miR-133的表達下降[20]。有研究表明，正常心肌細胞中miR-133能抑制血清反應因子(serum response factor，SRF)的激活，而VMC患兒心肌細胞中miR-133表達下調，結合在啟動子調控區的SRF被激活，從而促進了心肌細胞特異性生長和分化因子的表達，進而促使心肌細胞肥大，結構重塑[21]。此外，miR-133水平降低后，其喪失了對肌成纖維細胞的Cyclin D1的抑制作用，肌成纖維細胞將過度增殖，從而促進間質纖維化形成[21]。本研究中，VMC患兒血清miR-133的表達與CD4+/CD8+呈正相關，與心肌損傷指標CK-MB、cTnI呈負相關，表明miR-133同樣參與了VMC中炎性反應免疫調控，影響心肌細胞損傷的過程[22]。

綜上所述，VMC患兒血清miR-133表達水平降低，而miR-155表達水平升高，兩者均與部分心肌損傷及免疫功能指標存在相關性，其參與了VMC發生、發展的過程，檢測VMC患兒血清miR-133和miR-155表達水平可能有助于疾病診斷、病情嚴重程度判斷。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

鄧國清：提出研究方向、研究思路、研究選題；魯利群：設計研究方案、研究流程；楊欣：實施研究過程，數據收集，分析整理；賀靜：進行文獻調研與整理；王旭：設計論文框架，撰寫論文；黃莉：起草論文、修訂論文、論文終審