miR-17-92通過靶向抑制QKI促進結直腸癌轉移

肖慧敏，柳青峰，臧輝，肖明明，孫田，褚飛，祖富強

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是當今世界上最常見的惡性腫瘤和導致人類死亡的原因之一，在世界范圍內的發病率較高。在我國，結直腸癌的發病率更是呈逐年上升趨勢，嚴重威脅國人生命健康[1]。結直腸癌是一個多基因、多階段、長期形成的復雜的病變過程。目前為止，結直腸癌細胞的惡性生物學行為的調控機制仍未完全明確。近年來對非編碼基因組序列的研究揭示，微小RNA (MicroRNAs, miRNAs)在腫瘤的發病機制中發揮著作用。許多miRNAs存在于結直腸癌腫瘤組織和血液中, 并對其發生、發展產生重要影響[2]。miR-17-92 基因簇是一個高度保守的基因簇，由6個miRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a)組成[3]，由于它與多種實體瘤的發生密切相關而受到廣泛關注。已有研究表明，miR-17-92簇中的6個miRNA均在CRC腫瘤組織中表達增加(相比于正常組織)[4]。RNA結合蛋白QKI蛋白影響細胞的增殖和組織器官的分化，與其在惡性腫瘤中的作用密切相關[5]。由RNA結合蛋白和miRNAs所介導的轉錄后調控已經成為基因調控的主要方式，對疾病的演變、癌變的發生等具有重要意義[6]。本研究通過qRT-PCR、Western blot探討miR-17-92和QKI在結直腸癌中的表達關系，并通過轉染結腸癌SW480細胞過表達miR-20a和共轉染過表達QKI，檢測細胞的遷移能力，探討miR-17-92和QKI對結直腸癌轉移的調控機制，為結直腸癌的臨床診斷和靶向治療提供新的依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源： 收集2017年1月—2017年12月就診于遼寧省人民醫院具有完整臨床資料的CRC患者新鮮手術切除標本及新鮮癌旁組織29例，置于液氮中冷凍保存，用于qRT-PCR檢測。29例患者術后病理均證實為腺癌。人結直腸癌細胞系SW480購自中科院上海細胞庫，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養。

1.1.2 主要試劑： QKI兔抗人多克隆抗體購自美國Proteintech公司。RNA分離試劑盒Trizol、逆轉錄試劑盒(DRR037S)、SYBR Green II實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司，轉染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。miR-20a和內參U6的qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司設計合成， miR-20a模擬物、miRNA模擬物陰性對照均由上海吉瑪公司合成。pCMV6-Myc-DDK、pCMV6-Myc-DDK-QKI(RC205779)均購自OriGene公司。

1.2 實驗方法

1．2.1 qRT-PCR： 采用RNA分離Trizol試劑盒提取并純化總RNA，根據Takara逆轉錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。反應條件：95℃變性5 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環，均設立復孔進行重復。以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。反應完成后得到標本中靶基因的閾值循環數(CT)值，與對應U6的CT值相減，得到校正CT值。以正常癌旁組織為對照，計算癌組織的相對表達值。癌組織/癌旁組織=2-ΔΔct；ΔΔct=(Δct癌組織目的基因-Δct癌組織內參基因)-(Δct癌旁組織目的基因-Δct癌旁組織內參基因)。

1.2.2 Western Blot： 收集細胞，PBS 重懸，低溫離心(4℃， 2 000 r/min)5 min,棄去 PBS，干燥潔凈濾紙輕柔吸凈其余液體。用4 ℃預冷的裂解緩沖液處理胞，冰上25 min，期間反復混勻裂解液，低溫高速離心(4℃，12 000 r/min)20 min，取其上清液，以提取總蛋白。經BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，樣品均定量為同一水平，利用10%的SDS-PAGE電泳，并轉印至PVDF膜(提前浸泡甲醇溶液中進行膜軟化)。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h。采用ECL發光方法，并用Bioimaging system采集發光信號。

1.2.3 細胞轉染技術： 用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen)轉染試劑進行轉染，根據試劑說明書進行配液及轉染或干擾相關實驗。6 h后采用10%胎牛血清的培養基進行換液。轉染后48 h收集細胞，并通過qRT-PCR及Western blot驗證轉染效率。

1.2.4 遷移實驗(Transwell 法): SW480轉染miR-20a模擬物和QKI過表達質粒后24 h，常規消化至單個細胞，重懸并重新計算細胞數目，調整單個的細胞密度變為10×104/ml，取其中的300 μl細胞懸液用移液器分別加至未鋪有和鋪有基質膠的Transwell上室，下室加入600 μl含有20%FBS的新鮮培養基，48 h后，取出小室，棉簽輕輕擦凈Transwell小室上室上層細胞，冰甲醇固定30 min，棄去冰甲醇，待其揮發凈后，0.1%結晶紫染色30 min，PBS清洗至清潔，晾干，顯微鏡下每孔任意選取3個200×視野拍照，并進行計數，取其平均值進行分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量數據均采用3次以上的獨立實驗獲得，符合正態分布的用平均值±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗；計數數據用頻率表示，組間比較采用χ2檢驗。mRNA和蛋白表達的相關性采用Pearson相關系數分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-20a在腸癌和癌旁組織中的表達 qRT-PCR檢測29例結直腸癌患者中腸癌組織和癌旁正常組織miR-20a的表達水平。結果顯示，在29例患者中25例(86.21%)腺癌組織miR-20a表達較癌旁組織上調,4例(13.79%)腸癌組織miR-20a表達較癌旁組織下調，差異有統計學意義(t=4.099,P=0.000)。

2.2 QKI蛋白在腸癌和癌旁組織中的表達 Western blot檢測29例結直腸癌患者中腸癌組織和癌旁正常組織中QKI蛋白表達水平。結果顯示，23例(79.31%)腺癌組織中QKI蛋白表達明顯低于癌旁正常組織(t=3.037,P=0.005)，見圖1。

注：N 1-4.癌旁組織； T 1-4.腺癌組織

2.3 miR-20a和QKI蛋白在腸癌和癌旁組織中表達關系 Pearson相關系數分析顯示，miR-20a與QKI蛋白表達呈負相關(r=-0.437，P=0.018)。

2.4 過表達miR-20a可下調QKI蛋白的表達 在結腸癌SW480細胞轉染miR-20a模擬物后，采用qRT-PCR技術驗證其轉染效率，采用Western blot檢測細胞內的QKI蛋白表達水平。結果顯示，過表達miR-20a后，細胞內QKI蛋白表達顯著減少；在共轉染QKI過表達質粒后，QKI蛋白表達水平有所回升，見圖2、圖3。

2.5 miR-20a和QKI共同影響結直腸癌的轉移 Transwell遷移實驗結果表明，過表達miR-20a后，SW480細胞的遷移數目顯著增多(P<0.05),這種增強作用在共轉染QKI過表達質粒后有所減弱，圖4見封3。

注：與Blank、miR-ctrl比較，aP<0.05

3 討 論

微小RNAs是一類長度為20～25個核酸的內源性非編碼單鏈RNA，進化上高度保守[7-8]。miRNAs本身不翻譯成蛋白質[9-10]，在原核、真核生物中主要參與轉錄后基因表達[11]，其起作用的方式是與靶基因的mRNA完全或者部分配對，介導靶基因mRNA直接降解或者抑制其編碼蛋白質的翻譯，從而調節多種生物學過程，包括細胞增殖、細胞分化、細胞侵襲、細胞遷移、細胞調亡和周期調控等[12-15]。2004年，miR-17-92基因簇在彌漫性大B細胞淋巴瘤中首次被報道為癌基因[16]。并很快被證實其作為c-myc的下游，并與E2F轉錄網形成自循環體系，調控細胞增殖[17-19]。已有研究證實，在大腸癌中，miR-17-92基因簇通過抑制E2F1的翻譯促進癌細胞的增殖[20]。本研究證實miR-17-92基因簇在結直腸癌組織中較正常結直腸組織呈高表達。并通過進一步的研究發現miR-17-92基因可增強結腸癌SW480細胞的遷移能力，從而促進結直腸癌的轉移。

注：與miR-ctrl比較，aP<0.05；與miR-20a+vec比較，bP<0.05

RNA結合蛋白QKI是信號轉導與RNA活化蛋白(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族中的一員，主要包含 QKI-5、QKI-6 和 QKI-7等3個亞型[21-22]。QKI是一個重要的轉錄后調控因子，通過結合下游靶分子在轉錄后多個層次對靶基因的表達進行調節，如增強mRNA的穩定性、抑制蛋白的翻譯、調控mRNA的可變剪接[23-25]。過表達QKI-5和QKI-6均可以增強內源性β-catenin在細胞膜的表達水平，降低其在細胞漿和細胞核的分布，抑制β-catenin的轉錄活性，阻斷Wnt信號通路，從而抑制細胞增殖，促進腸道上皮細胞的分化[26]。有研究表明，QKI啟動子甲基化及QKI mRNA表達降低可能是結直腸癌發生、發展的重要原因[27]。另有研究顯示，比對不同分化水平的直腸癌組織，隨著分化程度的不斷降低而QKI-5的表達水平也隨之降低，且與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、遠端轉移、腫瘤標志物CEA水平密切相關[28]。本研究證實QKI在結直腸癌組織中較正常結直腸組織呈低表達。在此基礎上，發現miR-17-92基因簇與QKI在結直腸癌組織中的表達呈負相關關系。并且通過細胞轉染，利用Western blot檢測和Transwell遷移實驗，進一步揭示了miR-17-92基因簇可通過下調轉錄后調控因子QKI，增強結直腸癌細胞的遷移能力，從而促進結直腸癌的轉移。為臨床提供了一個結直腸癌潛在的診斷和治療靶點。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

肖慧敏：設計研究方案，實施研究過程，統計學分析，論文撰寫，論文修訂；柳青峰：課題設計，論文審核；臧輝、肖明明：提出研究方向、研究思路，論文修訂；孫田、褚飛、祖富強：文獻調研與整理，論文撰寫