北京地區規模化奶牛場副結核流行病學調查

陳豐偉 , 曹 杰 , 馬 翀 , 張 巽

(1.海南農墾草畜產業集團有限公司 ， 海南 澄邁 571900 ; 2.中國農業大學動物醫學院 ，北京 海淀 100193 ; 3.中牧實業股份有限公司 ， 北京 豐臺 100071)

奶牛副結核(Johne′s Disease，JD)，是一種慢性肉芽腫胃腸道疾病，其致病菌為副結核分支桿菌(MycobacteriumaviumsubspeciesParatuberculosis，MAP)。牛只在感染MAP后，通常經過1年以上的潛伏期后，會表現出臨床癥狀，主要癥狀包括腹瀉、體重迅速減輕、產奶量下降等。感染奶牛的體況評分最后會達到1分甚至更低，并最終因失去生產能力而被淘汰。感染牛在發病腹瀉過程中會將大量MAP排入環境，威脅易感牛群。2001年，加拿大的JD陽性牛場平均場內陽性率達到8.5%[1]，2005年澳大利亞全國奶牛的MAP血清抗體陽性率達到19%[2]。環境保護、飼養隔離工作不到位等原因，造成了MAP的高感染率[3]。2013年有學者報道美國91.1%的奶牛場存在JD牛[4]。由于當前國際上缺乏針對JD的特效藥物和可用疫苗，各國都采取JD控制計劃逐漸降低感染率。

本試驗對北京地區7個規模化奶牛場進行調查，目的是為了確定這些牛場的場間血清抗體陽性率以及場內血清抗體陽性率，以各場的MAP血清抗體陽性率為基礎，為后續控制計劃的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗對象 本試驗收集的樣品采集于2014年9-10月，選擇北京地區7個規模化奶牛場(>500頭存欄)。尾靜脈采血，分離血清0.5 mL，-20 ℃冰箱凍存備檢。為保護奶牛場的個體隱私，在此僅進行場間陽性率對比分析，并在結果中取消區域性特征的描述。

1.2 試驗材料 MAP抗體ELISA試劑盒(IDEXX公司)，2 mL注射器，離心管，96孔PCR板(用于儲存血清樣品)，96孔空白孵育板，移液槍，槍頭，熱電Wellwash 4MK2型洗板機以及酶標儀(ThermoFisher公司)，去離子水。

1.3 試驗方法 采用MAP抗體ELISA檢測試劑盒(IDEXX公司)進行檢測血清中的IgG。檢測按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 數據處理 根據試劑盒說明書判定標準進行判定，將可疑牛視為陰性。統計場間陽性率，場內陽性率，牛只陽性率，以及陽性牛月齡分布等。

2 結果

去除掉信息不齊全和重復的樣品后，最終總計采集8 549頭牛的血清樣品。

2.1 個體牛MAP血清抗體陽性率 7個牧場共檢測8 549頭牛，MAP血清抗體陽性牛數共791頭，個體牛MAP血清抗體陽性率達到9.25%(表1)。血清抗體陽性牛主要集中在成母牛，犢牛和育成牛的血清抗體陽性率均低于1%。因此以后進行JD控制計劃時，可以不采集小于等于12月齡牛的樣品。

表1 各養殖階段MAP血清抗體陽性率

2.2 各場MAP血清抗體陽性率 7個牛場的場間MAP血清抗體陽性率達到100%(7/7)，場內MAP血清抗體陽性率為5.08%～12.62%(表2)。其中2號場、4號場、6號場抗體陽性率均大于10%。表明MAP感染普遍存在，不同牛場感染情況存在差異。

表2 各場MAP血清抗體陽性率

2.3 不同月齡牛MAP血清抗體陽性率 按照6個月為一個區間進行劃分，對不同月齡區間牛MAP血清抗體陽性率分析。結果顯示，各月齡區間均存在血清抗體陽性牛，且主要集中在25-96月齡范圍內(圖1)。24月齡以下的各個區間陽性率均低于4%，并呈現隨月齡上升的趨勢。24月齡以下共計檢測牛3 441頭，其中血清抗體陽性牛僅56頭，陽性率為1.63%。25-96月齡范圍內各個區間的陽性率均大于10%，在該月齡范圍內共計檢測牛4 872頭，其中陽性牛712頭，陽性率為14.61%。96月齡以上的各個區間陽性率有所起伏：97-102月齡區間陽性率小于4%；103-108月齡和109-114月齡區間陽性率分別為8.33%和8.16%；115月齡以后的陽性率均大于12%。本次96月齡以上共計檢測牛236頭，其中血清抗體陽性牛23頭，陽性率為9.75%。

2.4 MAP血清抗體陽性牛S/P值分布情況 S/P值(Sample to positive value)反映了MAP抗體的滴度。陽性判定標準為樣品S/P≥0.55，即0.55為判定界限值(Cut-off)。Michael認為可以根據S/P值進行感染程度的分級[5-6],在此我們針對7個場陽性牛的S/P值進行分級分析。

結果顯示，在MAP血清抗體陽性牛中，強陽性牛占12.52%，中等陽性牛占55.50%，弱陽性牛占31.98%(表3)。使用R語言進行正態性檢驗，結果表明，MAP血清抗體陽性牛的S/P值不呈現正態分布(圖2)。對S/P值使用GLM分析發現，不同月齡的陽性牛，其S/P值存在極顯著差異(P<0.01)。進一步Duncan檢驗發現，月齡高的陽性牛S/P顯著大于月齡低的陽性牛S/P(表4)。

圖1 各月齡區間MAP血清抗體陽性率

表3 MAP血清抗體陽性牛S/P值 (n=791)

圖2 MAP血清抗體陽性牛S/P值正態性檢驗圖

表4 7場血清抗體陽性牛S/P月齡區間的Duncan檢驗 (n=791)

3 討論

JD作為一種慢性腸道疾病，較難做到早期診斷和防控，其臨床病程較為復雜，感染牛只可向環境中排菌，對易感牛群構成威脅。國內外近年報道全球JD牛檢出率一直保持上升趨勢。JD牛進入臨床期后，會表現腹瀉、產奶量降低等癥狀，導致牛群淘汰率升高，同時影響全群牛型結核的檢疫結果。不僅影響牛場生產收入，也浪費了大量的飼料、人工費用。2008年因JD牛問題，美國牛場經濟損失超過2.5億美元。

本次JD流行病學調查在北京市不同區縣的7個規模化奶牛場開展。結果顯示，場間血清抗體陽性率達到100%(7/7)，場內血清抗體陽性率為5.08%～12.62%，個體牛血清抗體陽性率為9.25%。上述結果表明，JD是北京乃至整個華北地區牛場的普遍性問題(考慮北京防疫工作)，且感染牛群基數較大，提示JD已經存在于各個牧場較長時間。其原因主要是此前國內牛場并未關注JD，牛只腹瀉未經過系統診斷，直接采用抗生素輸液治療，因此感染牛逐漸增多并發展到如今的狀態。這些牛場均需要開展JD控制計劃，同時應當注意避免向其他牛場輸出MAP血清抗體陽性牛。

本試驗結果顯示，犢牛和育成牛的MAP血清抗體陽性率分別為0.43%和0.49%，青年牛的陽性率達到2.47%。感染了MAP的犢牛和育成牛，機體主要是以細胞免疫為主，此階段進行血清學檢測的敏感性低。表明感染牛通常在12月齡以后表現MAP血清抗體陽性。考慮到采樣難度和血清抗體陽性檢出率不同階段差異的特點，對于實施JD控制計劃的牛場，我們建議僅對大于12月齡牛群采集血樣。

犢牛作為MAP最易感群體，是JD控制計劃的最重要環節。牛場應當針對犢牛管理和產房管理進行調整，確實切斷各種可能的傳播途徑。

本試驗中，24-96月齡范圍內的奶牛的陽性率較高(14.61%)，與犢牛期間感染MAP，并在24月齡以后表現抗體陽性的感染特點相吻合。24月齡以上奶牛作為控制計劃的主要對象，牛場要對血清抗體陽性牛進行標記，并棄用初乳，若出現臨床癥狀應立即淘汰。96月齡以上各區間血清抗體陽性率波動較大，可能與樣本數量有關，因為高齡牛通常無法達到生產要求或者因為各類疾病、流產已經淘汰。同時高齡牛因為免疫能力的下降，其更容易感染MAP。對于這類牛只尤其是有臨床癥狀的建議盡早淘汰。Nielsen S S[7]等人關于奶牛的MAP排菌狀態的研究，提示感染牛一般在24月齡后開始以體液免疫應答，與本試驗結果基本吻合，而關于感染狀態和排菌情況之間關系有待進一步深入研究。

IDEXX公司生產的MAP抗體ELSIA試劑盒,其檢測原理是以包被MAP特異性抗原為基礎的間接ELISA試驗，最終通過終止反應體系的光密度(OD值)來獲得樣品中的抗體滴度。此試劑盒的特異性為99.42%[8]，敏感性為45%[9]。由于不同批次試驗的差異，該試劑盒對此進行數據校正，即通過計算獲得S/P值(樣品陽性比率)，其計算公式為：S/P=(樣品OD值-陰性對照OD值)/(平均陽性對照OD值-陰性對照OD值)。根據公式可知在消除批次差異的同時，S/P與樣品OD值、抗體滴度，呈正向線性關系。我們對791頭血清抗體陽性牛進行分析發現，月齡越高，S/P值越高。這說明了牛只感染MAP的時間越長，其病程階段更嚴重，對環境的污染和牛群的健康更加不利。本試驗基于S/P值分級，發現強陽性牛(S/P≥2)占12.52%(99/791)。Michael等人建議，對強陽性牛停止配種工作以防止其進入下一個泌乳期。對于中等陽性和弱陽性牛，牛場應當做好經濟效益與牛群健康關系的權衡，一旦這些牛只出現臨床癥狀應立即淘汰[6]。

上述7個牛場，在近年的牛型結核皮試檢疫工作中，曾出現大量假陽性牛。例如2號奶牛場曾經在一次牛型結核檢疫中出現皮試陽性和可疑牛共計600頭，但是經過牛型結核IFN-γ試驗篩查后僅1頭為陽性。本試驗認為，JD會干擾牛型結核檢疫結果，其干擾率有待進一步試驗證明。

綜上所述，北京規模化奶牛場MAP感染情況不容樂觀，為有效控制感染率，以及避免感染對牛場生產帶來的負面影響，建議陽性牛場開展JD控制計劃。