鎮江地區副豬嗜血桿菌分離鑒定血清型及耐藥性檢測

朱孟玲 ， 劉慶新 ， 孫智遠 ， 徐云明 ， 章 琰 ， 王永娟

(1.江蘇農林職業技術學院 ， 江蘇 鎮江 212000 ；2. 江蘇農牧科技職業學院 ， 江蘇 泰州 225300)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是臨床中豬呼吸道常見的一種革蘭陰性菌，該菌的形態具有多形性，主要侵害4～8周齡仔豬，臨床中主要表現為纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關節炎及腦膜炎等多種癥狀，其仔豬的發病率為10%～15%以上，嚴重時死亡率可達50%[1-3]。研究表明，Hps在英國、澳大利亞、美國等多個國家及我國的黑龍江省、遼寧省、山東省、河南省等多個地區普遍流行，該病與豬藍耳病、圓環病毒等病毒病混合感染，在我國其感染造成的損失相當嚴重，該病已經成為影響全球養豬業健康發展的主要細菌病之一[4]。Hps具有15個血清型， 20%左右的分離菌株未能鑒定出血清型，不同的地區流行的血清型不同，商品化疫苗難以對各種血清型Hps提供完全交叉保護[5-6]。Hps的防治主要依靠抗菌藥物，但由于長期不合理使用，導致Hps對臨床中常用抗菌藥物產生耐藥性，降低其治療效果[7-8]。

本試驗從鎮江地區85份患病豬的病料組織中分離得到了48株副豬嗜血桿菌，對分離的48株副豬嗜血桿菌分離菌株進行血清型分布及耐藥性檢測，為該地區副豬嗜血桿菌的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2019年3-6月，采集鎮江地區不同養殖場中患病仔豬的肺臟、肝臟、關節滲出液等病料組織85份。

1.2 主要試劑與儀器 巧克力培養基、7%綿羊血培養基、胰蛋白胨大豆固體培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，均購自青島高科園海博技術有限公司；生化微量管,購自北京奧博星生物技術有限公司；200 mL無支原體胎牛血清,購自浙江天杭生物科技股份有限公司；氧化型輔酶1(NAD),購自北京索萊寶科技有限公司；2×TaqMarker Mix,購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL-2 000 Marker,購自北京中科瑞泰生物公司；細菌藥敏紙片，購自溫州康泰生物科技有限公司。梯度PCR儀由美國ABI公司生產；凝膠成像系統由美國伯樂公司生產；恒溫培養箱、恒溫水浴鍋，均由上海恒一科技有限公司生產；常規的試劑與儀器由本實驗提供。

1.3 分離與鑒定 將采集的患病仔豬的肺臟、肝臟、關節滲出液等病料組織進行處理后，接種于7%綿羊血培養基上，在37 ℃恒溫箱中培養18-24 h，挑取單個菌落分別接種在TSA 培養基和巧克力培養基上，37 ℃恒溫箱中培養24-36 h，挑取單個菌落在TSB 進行純化培養，進行革蘭染色鏡檢觀察其形態。

1.4 生化鑒定試驗 取純化分離菌株，按照說明書接種于生化試劑管中，對分離菌株進行生化鑒定。

1.5 分離菌株的PCR鑒定 參考文獻[4]合成Hps特異性鑒定引物。P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGT-3′，P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，目的基因片段840 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，以提取的DNA為模板，用Hps特異性鑒定引物進行PCR鑒定，其分離菌株的 PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與GenBank中登錄參考株進行同源性比較。

1.6 分離菌株的血清型鑒定 參考文獻[9]，合成 14 個 Hps 血清型基因引物funB、wzx、glyC、wciP、wcwK、gltI、funQ、scdA、funV、funX、amtA、gltP、funAB和funI，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反應體系50 μL：2×TaqMarker 25 μL，引物P1、P2各2 μL，DNA模板2 μL，去離子水19 μL。94 ℃預變性 5 min; 94 ℃變性 30 s, 58 ℃復性30 s, 68 ℃延伸 60 s，30個循環;最后68 ℃延伸5 min。將擴增后的 PCR 產物于 1%瓊脂糖上凝膠電泳，電泳結束后用凝膠成像系統觀察結果并照相記錄。

1.7 分離菌株的藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行，按照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷與耐藥性分析。取純化培養的分離菌株，調整菌液濃度為0.5麥氏比濁度，均勻涂布于TSA，貼上藥敏紙片，37 ℃培養18-24 h，測量抑菌圈直徑(mm)。

2 結果

2.1 細菌分離與培養 疑似副豬嗜血桿菌在7%綿羊血培養基圓形的、邊緣整齊的、灰白色菌落；在TSA培養基上長出濕潤的、光滑的、邊緣整齊的、灰白色的菌落；在巧克力培養基上長出圓形的、隆起的、表面光滑的、整齊的、灰白半透明的菌落。革蘭染色鏡檢結果，分離菌株為短桿狀、球狀、桿狀等多形性。經統計，48株分離菌株與報道的副豬嗜血桿菌的培養特性及形態一致。

2.2 分離菌株生化鑒定結果 分離菌株均能分解果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和阿拉伯糖；不分解甘露醇；吲哚試驗為陰性；接觸酶試驗為陽性；脲酶、氧化酶、鳥氨酸脫氫酶均為陰性，經統計48株分離菌株的生化特性與報道的副豬嗜血桿菌生化特性基本相符。

2.3 細菌PCR鑒定結果 用副豬嗜血桿菌特異性鑒定引物對分離的48株分離菌株均擴增出大約為840 bp大小的目的基因(圖1)。測序結果顯示：分離的48株菌株的測序結果與GenBank庫中登錄的10株副豬嗜血桿菌參考株基因序列的同源性在97.9%～99.9%之間。說明分離的48株分離菌為副豬嗜血桿菌。

圖1 分離菌株PCR鑒定結果

2.4 血清型鑒定結果 分離的48株副豬嗜血桿菌用血清型基因引物擴增出7種血清型目的條帶(圖2)。經統計，血清5型和12型為該地區副豬嗜血桿菌流行的主要優勢血清型，分別占分離菌株的25.0%和31.3%(表1)。

圖2 分離菌株血清型PCR鑒定結果

表1 血清型檢測結果

2.5 耐藥性結果 由表2可知，分離的48株副豬嗜血桿菌對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、慶大霉素、青霉素4種藥物耐藥性最高，耐藥率在81.3%～100.0%之間；對氨芐西林、大觀霉素、多粘菌素、多西環素、氟苯尼考5種藥物耐藥率在50.0%～79.2%之間；對頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素5種藥物耐藥率相對較低，耐藥率在12.5%～25.0%之間。

表2 副豬嗜血桿菌耐藥性分析結果

3 討論

副豬嗜血桿菌是臨床中常見的危害養豬業的主要病原菌之一，該菌對仔豬危害較低，發病率10%～15%，但死亡率高達50%以上，Hps屬于條件致病菌，當外界環境改變或感染其他病原菌時，導致豬的抵抗力降低，可以誘導該病的發生與流行[8-10]。Hps主要通過空氣、直接接觸及排泄物等多種途徑傳播，該菌主要引起豬肺臟疾病，除直接引起患豬死亡外，還可以導致豬生長性能降低、繼發多種病原感染，從而使肉品質下降，引起食品安全問題[5-7]。因此，在養殖過程中要注意該病的防控，同時也要注意環境的消毒。本試驗從鎮江地區采集86份病料組織分離得到了48株副豬嗜血桿菌，說明副豬嗜血桿菌在該地區正在流行，應該引起重視。

目前報道Hps具有15個血清型，其中20%的臨床分離菌株不能成功分型。本試驗表明，分離的48株Hps具有7種血清型，其中以血清5型和12型為該地區副豬嗜血桿菌流行的主要優勢血清型，分別占分離菌株的25.0%和31.3%，可以將血清5型和12型作為研制滅活苗的候選菌株之一。蔡旭旺等[11]報道了我國副豬嗜血桿菌分離菌株以血清4型和5型為主要流行的血清型，其次是13型、14型和12型。于江等[12]報道了副豬嗜血桿分離菌株血清1型在我國也較為流行。說明了副豬嗜血桿分離菌株的血清型的流行情況可能因地區不同存在一定的差異性，因此，該菌的疫苗研制存在一定困難。

由于目前沒有有效疫苗用于預防副豬嗜血桿菌，抗生素成為防治該病的主要手段之一，不合理的使用，不僅導致副豬嗜血桿菌產生很強的耐藥性，同時還降低治療效果[13]。本試驗表明，分離的48株副豬嗜血桿菌對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、慶大霉素等9種藥物耐藥率在50.0%～100.0%之間，對其他藥物耐藥率在12.5%～25.0%之間。因而說明該區分離的副豬嗜血桿菌耐藥嚴重，可能與臨床不合理使用抗菌藥物有關，也可能由于副豬嗜血桿菌的耐藥機制發生改變引起耐藥性。因此，在發生該病時應該合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產生，提高治療效果。