內質網應激在不同鈣水平下對母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞的作用

邵丹丹，于秋麗，年未未，汪曉宇，張佳勇，唐樂，歐陽瑋，章子貴

1. 浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 321004 2. 浙江師范大學體育與健康學院，金華 321004 3. 浙江師范大學行知學院，金華 321004

氟是人體所需的微量元素，地方性氟中毒(簡稱地氟病)是長期過量攝入氟而引起全身性病變，其中以牙齒、骨骼受損最為明顯[1-2]。地氟病病區范圍廣，類型復雜，可分為飲水型、燃煤型和飲茶型3種類型[3]。過量氟還能透過血腦屏障，在腦組織中蓄積，引起腦組織過強的氧化應激反應，進而損傷神經系統[4]。機體攝入氟過量還能通過胎盤屏障，在子代機體中蓄積，并透過血腦屏障對子代動物腦結構和功能造成損傷[5]，但其分子機制尚未明了。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指由于某種原因使細胞內質網發生紊亂的一種亞細胞器病理過程。有研究表明，內質網應激參與了氟骨癥的發病機制[6]，但氟中毒引起的腦損傷是否伴有內質網應激的發生，目前尚未見報道。國內外流行病學調研結果表明，地氟病病區居民膳食普遍低鈣，膳食低鈣是地氟病的主要促發和加重因素[7-8]。因此，本研究擬以SD大鼠為實驗動物，在復制母鼠氟中毒模型的基礎上[9]，探討內質網應激在不同飼料鈣水平下對母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞的作用，評價膳食鈣對氟中毒的干預作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物與分組

選用清潔級初斷乳SD雌性大鼠75只，雄性25只，購自浙江省實驗動物中心(SCYK(浙)2003-0001)。飼養于標準環境，適應一周，將雌性大鼠隨機分成5組，每組15只，按表1以自由飲水方式染毒3個月，以母鼠血氟及尿氟含量作為亞慢性飲水型氟中毒動物模型復制成功的標準。

表1 亞慢性氟暴露母鼠實驗分組情況Table 1 Subgroups of female rats in subchronic fluorine expose experiments

染毒結束后，每晚8:00雌雄按1∶1的比例合籠交配，次日8:00檢查雌鼠的陰栓，記為妊娠0日齡，依次完成受孕工作，并記錄妊娠時間。取妊娠19 d的胎鼠20只進行相關實驗。母鼠產仔第4天將每窩仔鼠調整為6～8只，在第14天和18天，每窩雌雄各取1～2只，每組共20只，雌雄各半進行相關實驗。

1.2 主要實驗試劑

兔抗大鼠CRT、BIP和CHOP單克隆抗體(一抗，英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(二抗，杭州戴格)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血/尿氟、血/尿鈣的測定

1.3.1.1 電極法檢測大鼠血/尿氟濃度[10]

取血/尿樣與TISAB混合液(體積比1∶1)置于10 mL燒杯中，磁力攪拌器勻速攪拌，插入氟電極和甘汞電極。當電位值改變<0.1 mV·(2 min)-1時，讀取的電位值作為E1，然后再在被測液里增加≤0.1 mL的標準NaF溶液，使電位變化為20～30 mV。當電位值改變<0.1 mV·(2 min)-1時，讀取的電位值作為E2。根據2次電位值的差△E=E1-E2，依據公式計算血/尿氟的含量。

式中：Cx為血清中氟含量(mg·L-1)；Cs為添加的標準NaF溶液的濃度(mg·L-1)；Vs為添加的標準NaF溶液的體積(它的體積不能高于被測液體積的1/50)(mL)；Vx為樣品體積(mL)；△E為E1與E2之差(以20～30 mV為宜)。

1.3.1.2 采用半定量滴定法檢測大鼠血/尿鈣[11]

分別量取血/尿樣品、緩沖液和指示劑0.2、1.5和0.5 mL，完全混合均勻以后，等到1 min后呈現出櫻桃樣紅色。用乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)標準液滴定，一邊加試劑一邊搖勻直到看見杏黃色停止，并紀錄EGTA標準液的消耗量。樣品總鈣(mmol·L-1)=EGTA用量(mL)×10×0.25。

1.3.2 仔鼠腦海馬神經細胞內質網應激伴侶分子蛋白檢測

1.3.2.1 總蛋白提取

將海馬組織剪碎后，按每50 mg的海馬組織加入600 μL PIPA裂解液和PMSF混合液(質量比為99∶1)。每個蛋白樣品用勻漿器勻漿，冰上靜置10 min使之充分裂解。4 ℃、12 000 r·min-1，離心15 min。取上清，加入5×上樣緩沖液，比例為4∶1；混勻，放入100 ℃水浴鍋中煮沸5 min，使蛋白變性；分裝，-20 ℃保存。

1.3.2.2 Western Blot測定蛋白表達

測定胎鼠與14日齡、28日齡雌雄仔鼠腦海馬細胞中BIP、CHOP和CRT蛋白的表達水平。取各組仔鼠，迅速處死，取海馬，提取總蛋白、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜和顯影，蛋白條帶用Quantity One軟件分析系統掃描目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值，內參調整值=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值，計算每一組內參調整值與對照組內參調整值的比值，用以表征該孔樣品蛋白表達量。

1.4 數據處理

數據用SPSS20.0進行分析，結果以平均值±標準差(M±SD)表示，計量數據采用單因素方差分析和方差齊性檢驗，各組兩兩比較用LSD檢驗。以P<0.05、P<0.01為具有統計顯著性。

2 結果(Results)

2.1 亞慢性氟中毒母鼠氟斑牙觀察與其血氟/鈣和尿氟/鈣的測定

2.1.1 母鼠切齒觀察

亞慢性氟暴露母鼠氟斑牙情況如圖1所示，由圖1可知，氟暴露3個月，DZ組和LG組母鼠切齒表面光滑，表現正常；RF組與LF組母鼠牙面白堊色條紋明顯且面積較大，表現為明顯氟斑牙；HF組母鼠牙面白堊色條紋量少且面積較小，表現為輕度氟斑牙。

2.1.2 母鼠血氟/鈣和尿氟/鈣的測定結果

母鼠血氟/鈣和尿氟/鈣的測定結果如表2所示，由表2可知，與DZ組比，LF組母鼠的血氟含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與DZ組比，RF組、LF組和HF組母鼠的尿氟含量升高，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；與DZ組比，LG組、LF組母鼠的血鈣含量均下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與DZ組比，RF組、LG組和LF組母鼠的尿鈣含量均下降，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，HF組母鼠的尿鈣含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。以上結果表明，母鼠亞慢性氟中毒模型復制成功。

圖1 染毒后各組母鼠切齒比較注：A. DZ，B. RF，C. LG，D. LF，E. HF。Fig. 1 Comparison of teeth in different treatment groupsNote: A. DZ; B. RF; C. LG; D. LF; E. HF.

表2 母鼠血氟/鈣和尿氟/鈣的測定結果(M±SD，n=15)Table 2 The contents of blood fluoride/calcium and urine fluoride/calcium in mother rats (M±SD, n=15)

注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；#P<0.05、##P<0.01，與RF組比。
Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group;#P<0.05,##P<0.01, compared with RF group.

2.2 大鼠子代腦海馬神經細胞內質網應激伴侶分子BIP、CHOP和CRT蛋白表達水平檢測結果

2.2.1 胎鼠腦海馬神經細胞內質網應激伴侶分子BIP、CHOP和CRT蛋白表達的檢測結果

胎鼠海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達水平檢測結果如圖2所示，由圖2可知，與DZ組比，RF組、LF組BIP表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與DZ組比，HF組BIP表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組BIP表達水平顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，HF組BIP表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 胎鼠腦海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達水平檢測結果注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；# P<0.05、## P<0.01，與RF組比。Fig. 2 Results of BIP, CHOP and CRT protein expression in hippocampus of fetusNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with RF group.

與DZ組比，RF組、LF組CHOP表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組CHOP表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組CRT表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組CRT表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組CRT表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組CRT表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.2 14日齡仔鼠腦海馬神經細胞內質網應激伴侶分子BIP、CHOP和CRT蛋白表達的測定結果

14日齡雌仔鼠海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達水平檢測結果如圖3所示，圖3表明，與DZ組比，RF組、LF組BIP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與DZ組比，HF組BIP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組BIP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組BIP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組CHOP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組CHOP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組CHOP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組和HF組CRT蛋白表達均上升，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；與RF組比，LF組CRT蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組CRT蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 14日齡雌鼠腦海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；# P<0.05、## P<0.01，與RF組比。Fig. 3 Results of BIP, CHOP and CRT protein expression in hippocampus of 14-day-old female ratsNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with RF group.

14日齡雄仔鼠海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果如圖4所示，圖4表明，與DZ組比，RF組、LF組BIP表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組BIP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組BIP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組CHOP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組CHOP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組CHOP蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組CHOP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 14日齡雄鼠腦海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；# P<0.05、## P<0.01，與RF組比。Fig. 4 Results of BIP, CHOP and CRT protein expression in hippocampus of 14-day-old male ratsNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with RF group.

與DZ組比，LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組CRT表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3 28日齡仔鼠腦海馬神經細胞內質網應激伴侶分子BIP、CHOP和CRT蛋白表達的測定結果

28日齡雌仔鼠海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果如圖5所示，圖5表明，與DZ組比，RF組、LF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與RF組比，LF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)，HF組BIP表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組CHOP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，HF組CHOP表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組、LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；與RF組比，LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

28日齡雄仔鼠海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果如圖6所示，圖6表明，與DZ組比，RF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，LF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組BIP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，HF組BIP表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 28日齡雌鼠腦海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；# P<0.05、## P<0.01，與RF組比。Fig. 5 Results of BIP, CHOP and CRT protein expression in the hippocampus of 28-day-old female ratsNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with RF group.

圖6 28日齡雄鼠腦海馬BIP、CHOP和CRT蛋白表達檢測結果注：*P<0.05、**P<0.01，與DZ組比；# P<0.05、## P<0.01，與RF組比。Fig. 6 Results of BIP, CHOP and CRT protein expression in the hippocampus of 28-day-old male ratsNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with DZ group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with RF group.

與DZ組比，RF組、LF組CHOP表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組CHOP表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

與DZ組比，RF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)，LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與RF組比，LF組CRT表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

氟中毒能引起機體骨相和非骨相器官的損傷，使機體產生腦損傷[3]，過量攝入氟還能通過胎盤屏障，在子代機體中蓄積，并透過血腦屏障影響子代腦功能[5]，但其分子機制尚未明了。內質網是機體蛋白質加工、合成和運輸的重要場所，也是細胞內重要的鈣儲存庫之一。研究表明，細胞處于病毒感染、營養剝奪、Ca2+超載和氧化應激等環境時，會造成內質網功能障礙，折疊蛋白能力下降，最終使未折疊蛋白在內質網內積聚產生ERS[12]。ERS時，細胞為緩解ERS狀態，通過內質網與細胞核之間的信號反饋系統，調節內質網功能，減少未折疊蛋白的積聚，即未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)。UPR的主要功能有：①停止蛋白質轉運與翻譯，減少蛋白質在內質網內進一步積聚；②促進內質網伴侶分子表達，加速未折疊蛋白折疊；③激活內質網順式作用元件，降解錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白。

內質網途徑是caspase引發凋亡的3條途徑之一[13-15]，近年來逐漸引起關注。CHOP、BIP和CRT是ERS的伴侶分子，其作用是幫助細胞內多肽的結構完成正確組裝，并最終在組裝完成后與之分離[16]。CHOP又名生長阻滯和DNA損傷誘導性基因153，是內質網應激特異轉錄因子[17]。正常生理條件下，CHOP呈低表達狀態，當表達升高時，可抑制下游抑凋亡BCL-2等表達[18]，誘導細胞凋亡。BIP是鈣結合蛋白，正常生理條件下，BIP參與調控合成蛋白質的折疊與轉運，與內質網跨膜蛋白結合并抑制其活性，維持細胞內鈣平衡[19]。CRT是鈣網蛋白，參與蛋白質折疊，調控細胞內鈣穩態[20]。氟中毒屬于“鈣矛盾”疾病[21-22](即機體整體缺鈣而細胞內鈣離子超載)，細胞內Ca2+平衡紊亂會誘導BIP、CRT等的表達，誘發ERS，持久的ERS會誘導細胞凋亡，加重對組織細胞的損傷。本研究中，母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞CHOP、BIP和CRT蛋白表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)，這證明，母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞產生ERS，ERS可能參與了母鼠氟暴露后仔鼠腦損傷。

近年來，微量元素鈣與氟的關系令人關注。有研究表明，機體攝入過量氟后，氟可直接攻擊氧，干擾氧代謝導致活性氧(ROS)增多，從而影響細胞鈣離子通道、胞內鈣庫，導致鈣穩態失衡[23]。飼料低鈣高氟能使大鼠成骨、破骨功能活躍，并伴有骨組織細胞的內質網應激，加速骨轉換從而造成骨相器官的損傷[24]。本研究參照文獻報道的飼料低鈣劑量[25]，分別用高鈣和低鈣飼料喂養氟中毒母鼠，探討內質網應激在不同鈣水平下對母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞的作用。結果發現，食低鈣飼料和高氟水組的仔鼠海馬神經細胞BIP、CHOP和CRT蛋白表達水平與飲用高氟水組比升高十分顯著，而食用高鈣飼料和高氟水組的仔鼠與飲用高氟水組的仔鼠腦海馬細胞CHOP蛋白表達水平則顯著下降，BIP和CRT蛋白表達顯著上升或無明顯變化。這樣的實驗結果提示，適當水平的鈣攝入可能是氟中毒的治療途徑之一，而膳食低鈣可加重氟致腦損傷。

總之，內質網應激在不同鈣水平下對母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞的作用可能是：妊娠期，母鼠氟暴露后，氟通過胎盤屏障后在胎鼠體內積蓄，胎鼠體內的氟透過血腦屏障進入腦組織內，在仔鼠腦發育過程中，產生ERS，使內質網應激伴侶分子BIP、CHOP和CRT表達異常，最終導致腦損傷。而飼料高鈣(鈣含量7%)能逆轉仔鼠上述腦海馬細胞內質網應激伴侶分子的表達趨勢，從而改善母鼠氟暴露后仔鼠腦海馬細胞的損傷，飼料低鈣(鈣含量0.063%)與飲用高氟水對仔鼠腦海馬細胞具有協同毒性作用。上述研究結果也提示，雖然目前我國各飲水型地氟病區飲用水治理后氟含量都已基本達標，但改水前母體攝入過量氟對仔代腦功能的影響仍不容忽視。