新藤黃酸誘導腦膠質瘤細胞U87自噬的研究

王巧雪，程 卉，李慶林

(安徽中醫藥大學科研實驗中心 新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

自噬是一種程序性死亡方式，是進化過程中高度保守和至關重要的自我保護系統[1]。自噬發生過程中，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，代謝降解受損的細胞器，為細胞提供新的營養物質和能量[2-3]。自噬作為抗腫瘤藥物治療的潛在作用靶點近年來已得到確認，在腫瘤不同時期發揮著促生存或促死亡的不同作用。

膠質瘤被認為是人類最常見的惡性原發性腦腫瘤，年發病例數約為10萬人，占所有原發性腦腫瘤的54%[4]。在過去的50年里，腫瘤的治療取得重大進展，但在膠質瘤治療方面改進甚少。膠質瘤患者的中位生存時間僅有12～14個月，5年生存率低于5%[5]。快速的增殖和無法控制的侵襲一直是清除膠質瘤的障礙，雖然有效治療方案在被不斷探索，但大多數治療方案的療效是有限的。因此尋找安全有效的化學治療藥物是目前膠質瘤研究的熱點問題之一。

中藥藤黃分布于泰國、柬埔寨、印度和中國南部地區，傳統用于消腫、化瘀、止血等[6]。新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)是從藤黃中提取的主要活性化合物之一，近年來GNA的抗腫瘤作用已被人們認可。研究結果表明GNA具有廣譜和顯著的抗腫瘤活性，其機制與其促進腫瘤細胞發生不同的細胞死亡方式而抑制腫瘤細胞的增殖有關。因此，本實驗在前期研究的基礎上進一步探究GNA抑制腫瘤細胞增殖的作用是否與誘導膠質瘤U87細胞自噬有關。

1 材料

1.1 細胞和試藥 U87細胞：中國科學院上海細胞庫；GNA(純度99.0%，批號 20170503)：安徽中醫藥大學藥學院自制；DMEM培養基和胎牛血清、鏈霉素、青霉素：美國Gibico公司；噻唑藍[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)和吖啶橙(acridine orange，AO)：美國Sigma公司；微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、酵母自噬基因6同系物(Beclin-1)一抗：美國CST公司；辣根酶過氧化物標記的二抗：北京中杉金橋公司。

1.2 主要儀器 MCO175型CO2培養箱：日本SANYO公司；SW-CJ1F型潔凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；CK2型倒置顯微鏡、熒光顯微鏡：日本Olympus公司；SpectraMax M2e型多功能酶標儀：美國MD公司；電泳轉印系統、Gel DOC XR凝膠成像分析系統：美國Bio-Rad公司；FC500流式細胞儀：美國Beckman公司。

2 方法

2.1 U87細胞培養 將U87細胞接種于培養瓶中，培養基為DMEM(含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱，相對飽和濕度條件下培養，每隔2～3 d傳代1次，傳代比例為1∶3，取對數生長期細胞進行下述實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活性 取對數生長期的U87細胞，經胰酶消化收集細胞，調整成濃度為4×104/mL的細胞懸液，每孔100 μL，接種于96孔板，每組設6個復孔，并且設空白組和對照組。過夜確定細胞貼壁狀態良好后，實驗組按梯度加入不同濃度的GNA藥液(0、1、2、4、8、16、32 μmol/L)，分別孵育24、48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育箱避光孵育4 h后，小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩。用多功能酶標儀檢測波長490 nm的每孔光密度(optical density，OD)值。采用公式計算GNA對細胞的抑制率。細胞活力=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100%，A樣品為實驗組OD值；A空白為空白組OD值；A對照為對照組OD值。

2.3 細胞形態觀察 經胰酶消化后，U87細胞以4×104/mL的密度接種于培養瓶中，每瓶4 mL，待貼壁生長至80%～90%的密度，對照組換成完全培養基，實驗組換用含有4 μmol/L GNA的培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

2.4 MDC熒光染色檢測細胞自噬泡的形成 取對數生長期的U87細胞消化，細胞以每孔2×105接種到6孔板中，吸棄各孔舊培養基，按照實驗分組，正常組加入完全培養基，實驗組加入不同GNA(1、2、4 μmol/L)處理，培養24 h，棄去舊培養基，用PBS清洗3遍，每孔加入50 μmol/L的MDC染料500 μL，37 ℃培養箱中避光孵育30 min，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，再用PBS清凈，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內MDC標記的綠色熒光聚集點的強度。

2.5 AO染色流式細胞術觀察酸性囊泡細胞器(acidic vesicle organelles，AVO)的數量變化 取對數生長期的細胞接種于6孔板中，每孔約5×106個細胞，分別加入不同濃度的GNA(1、2、4 μmol/L)處理24 h，胰酶消化，離心，收集細胞。用PBS清洗3遍，用1 μg/mL的AO染料，避光染色30 min，PBS清凈后重懸，置于流式細胞儀檢測AVO數量。

2.6 Western blot法檢測U87細胞中自噬相關蛋白LC3和Beclin-1的表達 將U87細胞以每孔5×106個細胞接種于6 cm培養皿中，待密度長到70%～80%，不同濃度GNA(1、2、4 μmol/L)處理24 h，收集在RIPA裂解緩沖液，提取總蛋白，BCA測定法定量每種樣品的濃度。通過SDS-PAGE凝膠分離總蛋白質，濕轉到硝酸纖維素膜上，室溫下牛奶封閉3 h，振蕩器上一抗4 ℃震蕩過夜，用TBST洗滌后，加入HRP標記的二抗，孵育2 h，置于Protein Simple Alpha凝膠成像系統記錄圖片并分析蛋白表達變化。

3 結果

3.1 GNA對膠質瘤U87細胞增殖的抑制作用 不同濃度GNA處理細胞24、48 h后，U87細胞的存活率隨劑量和時間呈現依賴性下降。GNA作用膠質瘤U87細胞24 h的IC50為2.63 μmol/L，GNA作用膠質瘤U87細胞48 h的IC50為1.62 μmol/L。見圖1。

圖1 GNA對膠質瘤U87細胞活力的影響

3.2 不同濃度GNA處理膠質瘤U87細胞24 h后的細胞形態 對照組細胞貼壁牢固，細胞呈現長梭形或不規則形，觸角明顯，胞體透明，折光性好。GNA組細胞間隙增寬，無特定形態，細胞觸角收縮，皺縮變圓，貼壁不牢，胞內顆粒增多，折光度下降。見圖2。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B. 2.0 μmol/L GNA組

圖2倒置顯微鏡下觀察GNA對膠質瘤U87細胞形態的影響(10×10倍)

3.3 不同濃度GNA對膠質瘤U87細胞自噬泡形成的影響 實驗組U87細胞質出現大量MDC標記的熒光顆粒聚集，且熒光強度呈劑量依賴方式增加；而對照組處理中只觀察到少量自噬囊泡，表明GNA增加自噬過程中自噬泡的積累。見圖3。

3.4 GNA對膠質瘤U87細胞AVO數量的影響 通過用流式細胞儀分析，在GNA處理的膠質瘤U87細胞中檢測到大量的AVO，并以劑量依賴性方式增加紅染AVO的比例，這表明GNA可能誘導細胞發生自噬。見圖4。

3.5 不同濃度GNA對膠質瘤U87細胞內自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Becline-1表達的影響 GNA(1、2、4 μmol/L)作用膠質瘤U87細胞24 h后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴性升高，細胞內Beclin-1蛋白表達量呈劑量依賴性增加。結果提示GNA對膠質瘤U87細胞的增殖抑制作用可能與細胞自噬途徑相關。見圖5。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B.1.0 μmol/L GNA組；C. 2.0 μmol/L GNA組；D. 4.0 μmol/L GNA組

圖3不同濃度GNA對U87細胞自噬泡形成的影響(MDC熒光染色，10×20倍)

注：與GNA 0 μmol/L組比較，*P<0.05

4 討論

中藥藤黃的抗腫瘤成分主要是藤黃酸和GNA，與藤黃酸相比，GNA具有抗癌譜廣、作用強、毒性低、穩定性好等特點，有望成為新結構類型的抗腫瘤藥物[7]。近年來本課題組著力于GNA抗腫瘤作用的研究，現有研究結果表明GNA能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，如肝癌細胞、黑色素瘤B16細胞、非小細胞肺癌A549細胞、膠質母細胞瘤細胞、宮頸癌U251細胞等，體內外的實驗結果均表明GNA有顯著的抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用可能與腫瘤細胞凋亡、自噬有關[8-11]。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B.1.0 μmol/L GNA組；C. 2.0 μmol/L GNA組；D. 4.0 μmol/L GNA組；與0 μmol/L GNA組比較，*P<0.05

自噬是細胞通過典型雙層膜結構包裹細胞器、難降解物質和部分胞漿，形成自噬體，再運送至溶酶體與之融合，代謝降解受損的細胞器，為細胞提供新營養物質和能量的過程，是一種普遍存在于真核細胞中的現象[12]。MDC是一種趨向溶酶體的嗜酸性活細胞染料，可以特異性地標記成熟的自噬泡[13]。形成AVO是自噬的特征之一，AVO可以在細胞自噬過程中與AO結合，可以將細胞核和細胞質染色成明亮的綠色，使AVO呈鮮紅色[14]。酸性小泡的形成和促進自噬小體的運輸過程中，LC3蛋白的參與起重要作用[15]。在自噬發生時，LC蛋白由LC3-Ⅰ形式轉化為LC3-Ⅱ形式，LC3-Ⅱ在組裝溶酶體、自噬體及最后誘導激活自噬中起重要作用，因此在自噬分子水平的研究中，LC蛋白的轉化具有重要意義[16]。Beclin-1被明確是調控自噬的正因子，細胞發生惡性轉化大多存在Beclin-1雜合性缺失，在自噬過程中，Beclin-1不僅有利于吞噬泡的形成從而促進自噬體的形成，另外還有助于自噬體的成熟[17]。

本研究從細胞自噬的角度研究GNA對類膠質瘤細胞膠質瘤U87細胞增殖的抑制作用，結果提示在一定的范圍內GNA對膠質瘤U87細胞呈現劑量與時間依賴性。經MDC熒光染色和AO染色的流式細胞術發現，GNA處理24 h后的細胞內，自噬泡和酸性囊泡細胞器增加；經Western-blot檢測，GNA處理的膠質瘤U87細胞內自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴性升高，Beclin-1蛋白表達量均呈劑量依賴性增加，提示膠質瘤U87細胞的增殖抑制可能與細胞自噬途徑相關。

本研究表明，GNA引起膠質瘤U87細胞自噬過程的發生，而誘導細胞自噬也正是GNA發揮腫瘤抑制作用的機制之一，有關GNA誘導自噬的相關途徑尚待進一步研究。