基因芯片法與線性探針法對痰標本中結核分枝桿菌檢測的應用價值

鐘業騰，呂志輝，林 翀，林明冠，陳灼霖，蘇應仙，陳少文，裴 華

(1. 海南醫學院第二附屬醫院檢驗科，海南 海口 570311； 2. 海南省臨高縣疾病預防控制中心檢驗科，海南 臨高 571800)

結核病是當前危害人類健康最重要的慢性傳染病之一[1]，是全世界公共衛生面臨的重大威脅[2]。目前，全球結核病控制工作面臨著耐藥結核病疫情的嚴峻挑戰[3-4]，世界衛生組織(WHO)估計約2/3的結核病患者處于耐多藥的危險中[5]。實驗室的傳統檢測方法主要是痰涂片、痰培養及藥敏，臨床上診斷結核病的金標準是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的培養[6]，而診斷耐多藥結核病的傳統方法是抗結核藥物敏感試驗[7-8]。傳統檢測方法雖可靠，但費時、費力，不能完全滿足臨床診療需求，還可能造成耐多藥菌株增多和傳播[9]。因此，建立早期、快速的耐藥性檢測技術是當前控制結核病疫情的關鍵。目前，臨床實驗室用于檢測 MTB的快速分子生物學方法主要有基因芯片法和線性探針法，兩種方法均是通過檢測標本中 MTB 及其耐藥相關基因突變情況，判定是否感染 MTB 及其對利福平、異煙肼的耐藥情況，具有快速、簡便等特點，一次能同時檢測十幾至幾十個基因位點，適用于多位點分析[10]。國內很多地區開展了基因芯片法或線性探針法檢測 MTB 及其耐藥基因，可能是出于經濟成本的考慮，基本采用單個基因檢測方法，極少比較基因芯片法和線性探針法檢測 MTB及其耐藥基因效果的相關報道[11]。在結核病防治工作中，患者痰是最直接的標本來源，直接檢測痰中 MTB 及其耐藥基因，能更快地獲得 MTB 耐藥結果。本研究采用基因芯片法、線性探針法對海南地區疑似肺結核患者送檢的痰進行檢測，并與改良羅氏培養法進行比較；以比例法藥敏試驗為金標準，分析上述兩種方法檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能。

1 對象與方法

1.1 研究對象 根據國家衛生與計劃生育委員會制定的肺結核病診斷標準[6]，凡符合下列之一均納入疑似肺結核患者：(1)有肺結核可疑癥狀的5歲以下兒童，同時具備肺結核患者密切接觸史、結核菌素試驗強陽性和γ-干擾素釋放試驗陽性中任一條；(2)僅胸部影像學檢查顯示與活動性肺結核相符的病變。

按照以上診斷標準，將海南醫學院第二附屬醫院2018年3—7月門診和住院的106例疑似肺結核患者納入研究范圍，其中男性 76 例，年齡 17～84歲，女性30例，年齡1～87歲。每例患者留取3份痰標本，每份標本2～3 mL，留取質量較好的痰標本2份，各取1 mL混勻，共獲得106份混合痰標本，每份2 mL。每份標本同時進行結核菌涂片、改良羅氏培養藥敏試驗、基因芯片及線性探針耐藥基因檢測，質控菌株為 H37Rv ATCC 27294標準株，由國家疾病預防控制中心(CDC)結核病參比實驗室提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 SlideWasherTM8芯片洗干儀、Bi-oMixerTMⅡ芯片雜交儀、ExtractorTM36核酸快速提取儀和 LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等均為博奧生物集團有限公司生產，TwinCubator振動平臺儀器為德國 Hain Lifescience公司生產，TC-96/G/H(b)B基因擴增儀和 Life Express基因擴增儀均為杭州博日科技有限公司生產，BSC-1600ⅡB2型和 BSC-1600ⅡA2型生物安全柜均為蘇州安泰空

氣技術有限公司生產，BPX-272電熱恒溫培養箱為上海博迅公司生產。

1.2.2 試劑 MTB DNA 提取試劑和晶芯結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA 微陣列芯片法)均為北京博奧生物集團有限公司生產，GenoType MTBDRplus試劑盒(PCR-線性雜交酶顯色法)為德國Hain Lifescience公司生產，分枝桿菌藥敏培養基(比例法)、改良酸性羅氏培養基(培養法)、結核菌抗酸染色液、對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒定培養基均為珠海貝索生物技術有限公司生產。

1.3 痰標本處理及痰涂片抗酸染色檢查 取患者痰標本直接進行痰涂片鏡檢，嚴格按照《結核病實驗室檢驗規程》[12]的要求進行痰涂片抗酸染色檢查，再加入等量的現配4%NaOH 溶液，渦旋振蕩混合后，室溫靜止15 min，制成預處理痰標本。

1.4 改良羅氏培養法及菌種初步鑒定 用無菌吸管吸取已預處理的痰標本上清液，各取0．1 mL(2滴)分別接種至改良羅氏培養基、PNB和 TCH 鑒定培養基上，盡量使菌液均勻鋪滿斜面，置37 ℃培養，培養第3天觀察結果后，每周各觀察1次，直到第8周。

1.5 比例法藥物敏感試驗 用一次性無菌接種環刮取改良酸性羅氏培養基上(2～3周)的新鮮菌落，置于磨菌瓶中，研磨后與標準麥氏管比對制成1 mg/mL菌懸液，用滅菌生理鹽水稀釋成10-2mg/mL和10-4mg/mL 2個濃度，然后用一次性無菌接種蘸取1環(即10 μL)，采用劃線法分別均勻接種至中性羅氏培養基和含利福平(40 mg/L)、異煙肼(0．2 mg/L)的藥敏培養基上，37 ℃培養4周后觀察結果。

1.6 DNA提取 吸取1 mL已進行預處理的痰標本上清液于微量離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液；再加入1 mL的生理鹽水，充分振蕩后12 000 r/min離心5 min，棄去上清液；向微量離心管加入50 μL核酸提取液，混合均勻后，吸取所有混合液放入核酸提取管中，用核酸快速提取儀振蕩10 min，再置于95 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心1 min，制備成核酸提取物。

1.7 PCR擴增及雜交

1.7.1 基因芯片法 把 PCR 擴增試劑1、2、3(分別含有 MTB鑒定基因擴增引物、耐利福平rpoB基因擴增引物、耐異煙肼katG/inhA 基因擴增引物)按18 μL/管分裝于 PCR管中，將所得核酸提取物2 μL依次加入到PCR管中，混勻，每個標本重復3次，放入基因擴增儀進行擴增，得到PCR產物。將PCR產物經變性后按照說明書要求加入至 MTB耐藥檢測試劑盒的芯片點陣中，然后放入晶芯 Bi-oMixerTMⅡ雜交儀進行芯片反應，再將完成雜交的芯片放入晶芯SlideWasherTM8芯片洗干儀中進行洗干，將洗干的芯片放入晶芯 LuxScanTM10K-B 微陣列芯片掃描儀中，利用晶芯結核分枝桿菌藥敏檢測分析系統進行信號的讀取及結果判斷。

1.7.2 線性探針法 取核酸提取物5 μL加入用多重 PCR擴增體系(含有 MTB 鑒定基因擴增引物、耐利福平rpoB基因擴增引物和耐異煙肼katG/inhA基因擴增引物)中，放入基因擴增儀進行擴增，所得PCR產物與GenoType MTBDplus試劑盒中的探針試紙按說明書進行雜交，并判斷結果。

1.8 質量控制 嚴格按照《結核病實驗室檢驗規程》的要求進行質量控制，痰標本分枝桿菌分離培養的涂陽培陰率應小于10%，污染率應小于5%；比例法藥物敏感性試驗的高稀釋度菌液(10-4mg/mL)在中性羅氏培養基(對照培養基)上生長的菌落數少于20個菌落，則應從對照管傳代培養，重復試驗。海南醫學院第二附屬醫院結核病實驗室每年均通過國家抗結核藥敏試驗熟練度考核及結核病分子診斷技術能力驗證。

1.9 數據處理 應用 SPSS 20．0統計學軟件對實驗結果進行處理，兩種方法的一致性檢驗用Kappa檢驗判別(Kappa≥0．75，兩者一致性較好；0．4≤Kappa<0．75，兩者一致性一般；Kappa<0．4，兩者一致性較差)，采用卡方檢驗比較兩種方法檢測結果，P≤0．05為差異有統計學意義[13]。

2 結果

2.1 痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養結果 對106份痰標本進行涂片抗酸染色和改良羅氏培養，痰涂片抗酸染色陽性率34．91%(37/106)，改良羅氏培養陽性率52．83%(56/106)，涂陽培陰性率為8．11%(3/37)，未出現培養污染標本，兩者均符合質量控制的要求。56份培養陽性痰標本經PNB及TCH 培養鑒定，46株為 MTB和10株為非結核分枝桿菌。

2.2 基因芯片法和線性探針法MTB檢出情況 106份痰標本，基因芯片法檢出分枝桿菌52株，其中46株 MTB，6株非結核分枝桿菌；線性探針法檢出 MTB5 3株，基因芯片法、線性探針法 MTB的檢出率分別為43．40%、50．00%。基因芯片法、線性探針法與改良羅氏培養法檢測 MTB 結果比較，差異均無統計學意義(均P>0．05)。見表1。

表1106份痰標本基因芯片法和線性探針法 MTB檢出情況

Table1Detection of MTB from 106 sputum specimens by gene chip method and linear probe method

方法改良羅氏培養法(份)陽性陰性χ2P基因芯片法陽性40659.681.00陰性654線性探針法陽性391436.910.19陰性746

注：以改良羅氏培養法為金標準

2.3 基因芯片法和線性探針法檢測MTB對利福平、異煙肼的耐藥性 以比例法藥敏試驗為金標準，鑒定為 MTB的46株菌株均進行比例法藥敏試驗。同時采用基因芯片法和線性探針法檢測46株 MTB對利福平、異煙肼的耐藥性，兩種方法分別檢測出40、39株菌對兩種藥物的耐藥結果。

2.3.1 基因芯片法和線性探針法檢測MTB對利福平的耐藥性 基因芯片法、線性探針法與比例法檢測 MTB對利福平的耐藥性比較，差異均無統計學意義(均P>0．05)，具有較好一致性(Kappa分別為0．85、0．78)。見表2。對利福平的耐藥性檢測，基因芯片法和線性探針法的靈敏度、特異度、符合率、陽性預測值、陰性預測值見表3。

表2基因芯片法和線性探針法檢測 MTB對利福平的耐藥結果

Table2Rifampicin resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐藥敏感PKappa基因芯片法耐藥2221.000.85敏感115線性探針法耐藥2230.630.78敏感113

表3 基因芯片法和線性探針法檢測 MTB對利福平耐藥情況的診斷效能(%)

2.3.2 基因芯片法和線性探針法檢測MTB對異煙肼的耐藥性 基因芯片法、線性探針法與比例法檢測 MTB對異煙肼的耐藥性結果比較，差異均無統計學意義(均P>0．05)，但一致性一般(Kappa分別為0．70、0．59)。見表 4。對異煙肼的耐藥性檢測，基因芯片法和線性探針法的靈敏度、特異度、符合率、陽性預測值、陰性預測值見表5。

表4基因芯片法和線性探針法檢測 MTB對異煙肼的耐藥結果

Table4Isoniazid resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐藥敏感PKappa基因芯片法耐藥1810.220.70敏感516線性探針法耐藥1730.730.59敏感514

表5 基因芯片法和線性探針法檢測 MTB對異煙肼耐藥情況的診斷效能(%)

3 討論

臨床實驗室通常會對疑似肺結核患者的痰標本進行涂片抗酸染色和傳統培養，為臨床診斷提供實驗室的確診數據；但痰涂片抗酸染色陽性率偏低，又無法鑒定是否為 MTB，也不能區分死菌與活菌，不足以滿足臨床需求[14-15]；傳統培養法雖可以分離鑒定 MTB并可進行藥敏試驗，但是檢測時限過長，也不能滿足臨床診療及患者的需要[16]。隨著分子生物學的快速發展并在結核病的診療領域廣泛應用，線性探針法和基因芯片法均很好地用于 MTB耐藥基因檢測，原來至少需4～8周的時長，最快可縮短至1 d，節約臨床的診斷時間，也可防止MDR-TB的蔓延[17-18]。

基因芯片法與線性探針法雖檢測時長相差不大，但基因芯片法配有雜交儀、洗干儀及掃描儀等整套設備，自動化程度較高；而線性探針法僅配有雜交儀，雜交、洗滌及結果判讀等實驗步驟均需人工操作，人為影響因素較大，雜交時標本及探針試紙也暴露于空氣中，容易造成交叉污染，但線性探針具有儀器設備投入成本低、試劑成本相對較低的優勢。

本研究從檢出 MTB陽性率的角度分析了改良羅氏培養法、線性探針法及基因芯片法的優劣性。本研究中線性探針法 MTB檢出率為50．00%，低于郭明日等[19]報道的58%；基因芯片法 MTB檢出率為43．40%，高于吳國蘭等[20]報道的32．5%，兩種方法 MTB檢出率可能與患者所留痰標本的質量及保存條件有關。基因芯片法和改良羅氏培養法可直接鑒定出非結核分枝桿菌，而線性探針法不能鑒定出非結核分枝桿菌，因為線性探針法檢測耐藥基因試劑盒沒有相關檢測基因序列。線性探針法、基因芯片法對 MTB 的檢出率與改良羅氏培養法比較，差異均無統計學意義，說明基因芯片法和線性探針法均可很好地應用于痰標本中 MTB的鑒定。

以比例法藥敏試驗為金標準，采用基因芯片法和線性探針法檢測痰標本中 MTB利福平和異煙肼耐藥基因，基因芯片法對利福平和異煙肼的靈敏度為84．62%、69．23%，特異度為90．00%、95．00%，低于文獻[21-22]報道的結果，可能與地域差異或方法學的熟練度有關。線性探針法對利福平和異煙肼耐藥基因檢測的靈敏度為84．62%和65．38%，特異度均為85．00%，均低于文獻[23-24]報道(用線性探針法針對臨床分離株進行檢測)，本研究采用線性探針法直接檢測痰中 MTB耐藥基因。本研究采用線性探針法檢測痰標本，效果不如直接對臨床分離株檢測耐藥基因好，但可節省2～4周的時間[25]，可有效快速指導臨床用藥。對海南地區疑似肺結核患者的痰標本進行 MTB 的耐藥基因檢測，基因芯片法比線性探針法檢測效果相對好，可能是線性探針法在雜交過程與結果判讀均為人工，也可能是方法學或檢測的耐藥基因位點不同所致。

本研究檢測痰標本 MTB 中利福平耐藥基因，分別將兩種耐藥基因檢測方法與比例法藥敏試驗比較，結果差異均無統計學意義，具有較高一致性，故兩種耐藥基因檢測方法在檢測 MTB對利福平的耐藥性中有較好穩定性。檢測 MTB對異煙肼的耐藥性時，兩種方法與比例法藥敏試驗比較，差異均無統計學意義，但一致性一般，結果與歐維正等[11]研究有所不同，可能與地域差異或方法學的熟練度有關。

本研究也存在一些局限性：(1)由于成本問題，本研究標本數量相對不足，尤其是三種方法共同檢測陽性標本相對較少，在耐藥性評價中存在局限性；(2)兩種耐藥基因檢測方法所檢測耐藥基因位點有所不同，故無法對其基因突變類型進一步比較分析。研究首次采用兩種基因檢測方法直接檢測疑似肺結核痰標本中 MTB及其相關耐藥基因，比較全面、客觀地評價這兩種基因檢測方法在本地區結核病診斷中應用價值，為臨床實驗室方法學選擇及臨床診療提供參考。

綜上所述，基因芯片法和線性探針法均可在海南地區疑似肺結核痰標本中快速準確鑒定MTB，也適用于結核分枝桿菌對利福平及異煙肼耐藥性快速檢測，值得臨床推廣。