云南省艾滋病患者分離新生隱球菌的藥物敏感性檢測與分析

樊紅麗，高 麗，毛小琴，張 米，李正倫，楊翠先

(1. 云南省傳染病專科醫院/艾滋病關愛中心檢驗科，云南 昆明 650301； 2. 昆明理工大學醫學院,云南 昆明 650500； 3. 云南省第一人民醫院檢驗科,云南 昆明 650032)

截至2017年底，云南省累計報告存活人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者和艾滋病患者98 878例，居全國前五。隱球菌性腦膜炎常感染免疫力低下人群，尤其是艾滋病患者，其抗真菌治療效果差，是艾滋病患者死亡的主要原因之一[1]。在較長的抗真菌治療過程中(平均周期為12個月)，隱球菌對抗真菌藥物會產生耐藥，從而導致治療失敗[2]。因此，臨床治療需要實驗室的體外藥物敏感性報告作為依據。不同地區藥敏折點是有差異的[3]，目前，云南地區新生隱球菌常用藥物藥敏折點情況未見報道。對本院2007年8月—2018年7月艾滋病患者標本中分離的新生隱球菌菌株進行藥物敏感性檢測，并分析其報告，以期為本地區新生隱球菌的藥物敏感性折點建立提供數據。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 304 株新生隱球菌全部分離自云南省傳染病醫院住院艾滋病患者標本，患者來自云南省的16個地州市。同一患者相同標本分離的新生隱球菌均進行藥敏檢測，經比較檢測結果相同，僅納入一次檢測結果進行統計分析，同一患者不同標本分離的新生隱球菌均納入研究。質控菌株為克柔假絲酵母菌ATCC 6258 和近平滑假絲酵母菌ATCC 22019。

1.2 菌株培養及復核鑒定 將-80℃保存的臨床分離的新生隱球菌菌株置于20℃復蘇24 h，使其恢復繁殖活力。在無菌條件下，將其轉種至沙保羅(SGC)培養基上，25℃孵育培養48～72 h，形成肉眼可見的菌落，然后進行菌種復核鑒定。復核鑒定由本院微生物室工作人員參照全國臨床檢驗操作規程第四版要求[4]，即根據菌落生長特征、鏡下形態以及生化反應，結合VITEK 2 YST 卡進行菌種鑒定。

1.3 藥敏試驗 采用Thermo Fisher公司的真菌藥敏板進行藥敏試驗，即比色微量稀釋法，每塊藥敏板都包被有適當稀釋濃度的抗真菌藥物和顯色劑。在藥敏板中，各抗真菌藥物及濃度范圍分別為5-氟胞嘧啶0．06～64 μg/mL，泊沙康唑0．008～8 μg/mL，伏立康唑0．008～8 μg/mL，伊曲康唑0．015～16 μg/mL，氟康唑0．012～256 μg/mL，兩性霉素B0．12～8 μg/mL。實驗嚴格按照試劑盒說明書加樣后，在非CO2培養箱培養72 h 讀取結果。根據顏色改變目視觀察抑制微生物生長的抗真菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。實驗同時檢測克柔假絲酵母菌ATCC 6258和近平滑假絲酵母菌ATCC 22019進行質量控制。

1.4 結果判讀 藥物敏感性判斷參照全國臨床檢驗操作規程第四版[4]推薦的假絲酵母菌藥物敏感性判斷標準。

1.5 統計學處理 應用SPSS 19．0 統計軟件對6種抗真菌藥物的MIC50、MIC90和MIC 幾何均數進行分析。

2 結果

2.1 標本來源 共收集2007年8月—2018年7月云南省傳染病醫院住院艾滋病患者標本分離的新生隱球菌304株，標本來源見表1。骨髓中檢出隱球菌的11例患者中，在治療的不同時期，有5 例曾在患者血液中檢出，2 例曾在患者腦脊液中檢出，4例僅在骨髓中檢出。

表1304株新生隱球菌標本來源分布

Table1Distribution of specimen sources of 304 strains ofC.neoformans

標本類型分離株數構成比(%)腦脊液19263.16血9631.58骨髓113.62胸腔積液30.98痰10.33組織10.33

2.2 抗真菌藥物的敏感性

2.2.1 6 種常用抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC 值 藥敏試驗結果顯示，304株新生隱球菌對唑類抗真菌藥物(除氟康唑外)MIC均<1 μg/mL，多烯類的兩性霉素B MIC≤4 μg/mL，氟康唑及5-氟胞嘧啶的MIC≤32 μg/mL。見表2。

2.2.2 5 種抗真菌藥物對新生隱球菌的敏感性分析 未發現對伊曲康唑和氟康唑耐藥的菌株。詳見表3。

表26種抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC 值(μg/mL)

Table2MIC values of 6 kinds of antifungal agents againstC.neoformans(μg/mL)

抗真菌藥物MIC范圍MIC50MIC90MIC幾何均數5-氟胞嘧啶0.5～32242.32泊沙康唑0.015～0.50.120.250.09伏立康唑0.008～0.250.030.060.039伊曲康唑<0.015～0.50.060.120.053氟康唑0.12～32483.28兩性霉素B0.12～4110.75

表3304株新生隱球菌對5種抗真菌藥物的藥敏結果[%(株)]

Table3Antifungal susceptibility of 304 strains ofC.neoformansto 5 antifungal agents (%[No. of isolates])

抗真菌藥物敏感劑量依賴性敏感耐藥5-氟胞嘧啶95.39(290)4.28(13)0.33(1)伏立康唑98.68(300)0.0(0)1.32(4)伊曲康唑99.67(303)0.33(1)0.00(0)氟康唑97.04(295)2.96(9)0.00(0)兩性霉素B98.68(300)0.0(0)1.32(4)

注：泊沙康唑由于無體外藥敏試驗解釋，在此不進行判斷

3 討論

新生隱球菌屬條件致病菌，隨呼吸經肺部侵入人體，由血液播撒至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和關節。該菌的發病與免疫力低下，尤其是HIV 感染有密切的關系。本研究中，檢出新生隱球菌的標本類型以腦脊液和血液為主，占94．73%，其次為骨髓(11例，占3．62%)。據報道，新生隱球菌在廣西[5]、云南[6]以及長沙[7]地區艾滋病患者骨髓標本中的檢出率為2%～2．65%，與本研究結果基本一致。而在非艾滋病患者中[8-10]尚無骨髓檢出新生隱球菌的報道，可能與艾滋病患者免疫力低下，新生隱球菌更易侵犯骨髓所致，提示艾滋病患者可聯合采集腦脊液、血液和骨髓標本進行培養，以提高新生隱球菌的檢出率。

在艾滋病合并隱球菌性腦膜炎的患者中，治療初始階段就使用兩性霉素B 的患者，較初始時不使用此藥治療的患者死亡風險更低[11]。因此在艾滋病合并隱球菌感染的臨床路徑中，治療首選藥物推薦兩性霉素B 和5-氟胞嘧啶[2]。本研究中兩性霉素B對304 株新生隱球菌的MIC 范圍為0．12～4 μg/mL，MIC50和幾何均數(1 μg/mL 和0．75 μg/mL)均高于國內外的部分小樣本文獻[12-15]報道，如華東地區(96 株，MIC50為0．25 μg/mL，幾何均數為0．302 μg/mL)[9]，上海(35 株，MIC50為0．125 μg/mL，幾何均數為0．26 μg/mL)[16]，美國和日本(26 株，MIC50為0．0625 μg/mL)[17]。本研究的結果與國內[7-8]和國外[10，18-19]等檢測樣本量均大于100株的MIC50和幾何均數結果較一致。Espinel-Ingroff等[20]對全球3 590株新生隱球菌進行藥敏研究，結果顯示，兩性霉素B的MIC為2 μg/mL的菌株占0．95%(34株)，MIC為4的菌株占0．084%(3株)，與本次研究結果相近，提示擴大新生隱球菌藥敏實驗的樣本量，能更全面地反映新生隱球菌對抗真菌藥物的敏感性。在本研究中，有4株新生隱球菌兩性霉素B 的MIC≥2 μg/mL，其中有1株為4 μg/mL，屬罕見情況，因此對此4株菌抗真菌藥物藥物敏感性進行了復檢，復檢與初檢結果一致。出現此種情況可能與艾滋病患者播散性新生隱球菌的復發率高，反復使用兩性霉素B 治療有關，提示高耐藥株出現可能是無藥物選擇壓力下的一種宿主反應[3]。

在本研究中，氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的MIC50、MIC90和幾何均數均稍低于非HIV 感染性新生隱球菌有關研究[8-9]結果，與亞洲多中心的研究[21]結果一致，氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑對艾滋病患者分離的新生隱球菌菌株的MIC 值與非艾滋病患者分離的菌株差異無統計學意義，但是艾滋病患者MIC 幾何均數均小于非艾滋病患者。

本次研究以假絲酵母菌臨床菌株體外藥敏試驗解釋為藥敏折點，對新生隱球菌進行判斷，5種抗隱球菌藥物敏感率均達到95% 以上，伊曲康唑最敏感，敏感率達到99% 以上，遠高于相關文獻[3，7，9，21]報道。