HMGB1基因多態性與豫北地區肺結核易感性的相關性

喬瑞娟， 程 睿， 李 威， 彭火英， 趙桂增， 張晨光

(1.新鄉醫學院醫學檢驗學院，河南 新鄉 453003； 2.大慶油田總醫院檢驗科，黑龍江 大慶 163001)

肺結核病(pulmonary tuberculosis，PTB)是由結核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性肺部疾病，嚴重威脅人類健康[1]。全世界約有三分之一的人口感染了 MTB，但只有大約10%的感染者出現活動性結核病，而其余的則沒有癥狀[2]，由此表明個體遺傳因素與肺結核的易感性密切相關。單核苷酸多態性(SNPs)存在于人類染色體上且分布廣泛，其可能影響啟動子活性和基因表達，從而與疾病的發生發展有著密切的聯系。目前國內外研究發現許多基因多態性與肺結核易感性相關，如 CCL5、ASAP1、TLR10 基因內的特定SNPs變異[3-5]。位于13號染色體的高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)是一種在哺乳動物中發現的普遍存在的核蛋白。HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質，在腫瘤、免疫性疾病和感染性疾病的發病過程中起重要作用[6-8]。在抗結核感染過程中，MTB感染可以誘導單核及巨噬細胞分泌HMGB1，其濃度的高低可能反映結核病的嚴重程度[9]。由此推測HMGB1基因多態性可能與肺結核易感性有很大關聯。迄今為止還未發現關于HMGB1 SNPs與肺結核易感性之間的關聯研究。本研究是首次對豫北地區肺結核患者和健康人群HMGB1基因的3個SNPs進行病例對照研究，以探討HMGB1 SNPs與豫北地區肺結核患者易感性的相關性，為肺結核的診斷治療提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2017年1—12月在新鄉醫學院第一附屬醫院被確診為肺結核的320例患者作為結核組，診斷均符合我國肺結核的診斷標準(WS 196-2017)。排除標準為：(1)患心、肝、腎等疾病患者；(2)各類腫瘤及自身免疫性疾病患者；(3)慢性呼吸系統疾病如慢性支氣管炎、支氣管哮喘、支氣管擴張的患者；(4)慢性感染如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等患者。對照組由該院同時期300名健康體檢者組成，均無慢性疾病及傳染病。本研究經新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，事先獲得參與本次研究的每位患者和健康者的知情同意，自愿參與本項研究。

1.2 基因組DNA提取 結核組和對照組分別采集2～3 mL EDTA-K2抗凝全血，根據制造商的說明書，通過外周血基因組提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)從 EDTA-K2抗凝全血中分離出全血 DNA。提取的全血 DNA 保存于-20℃冰箱備用。

1.3 SNPs選擇及基因分型 選 擇 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個位點，都是常見SNPs，這些SNPs的次要等位基因頻率均≥5%。rs1412125、rs1045411、rs2249825引物序列見表1。PCR擴增體系共26 μL，包括2×PFUMasterMix 12．5 μL(北京康為世紀生物科技有限公司)、去離子水10．5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。HMGB1 rs1412125擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，55．9℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs1045411擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs2249825擴增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，57．6℃30 s，72℃ 2 min，共循環35次，最后在72℃延伸5 min。所有的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定擴增目的產物的有無。擴增產物送公司進行測序，測序結果通過DNASTAR V7.0軟件記錄相應的SNPs位點。

表1 HMGB1 SNPs引物序列

2 結果

2.1 基本情況 320例結核組患者中男性123例(38．44%)，女性197例(61．56%)，平均年齡(37．91±11．01)歲。對照組300名健康體檢者中男性102例(34．00%)，女性198例(66．00%)，平均年齡(38．57±10．89)歲。所有的參與者均為漢族。兩組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史情況比較，差異均無統計學意義(均P>0．05)。見表2。

2.2 兩組間的3個 HMGB1 SNPs等位基因和基因型分布比較 兩組間3個位點的基因型頻率均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0．05)。rs1045411G/A位點 A 等位基因與肺結核的發病風險相關(OR=1．485，95%CI=1．110～1．986，P=0．007)，但兩組間rs1412125A/G 和rs2249825C/G 位點等位基因頻率差異無統計學意義(P>0．05)。見表3。在健康對照和肺結核患者中，rs1412125A/G、rs1045411G/A、rs2249825C/G位點的基因型分布最高頻率分別為純合AA、GG、CC，結核組和對照組的rs1045411G/A 基因型分布差異有統計學意義(P<0．05)，而rs1412125A/G、rs2249825C/G 基因型分布在兩組間差異無統計學意義(P>0．05)，見表4。

表2結核組與對照組的基本特征[例(%)]

Table2Basic characteristics of tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

基本特征結核組(n=320)對照組(n=300)χ2P性別 女197(61.56)198(66.00)1.3190.251 男123(38.44)102(34.00)吸煙史 有97(30.31)105(35.00)1.5490.213 無223(69.69)195(65.00)飲酒史 有77(24.06)84(28.00)1.2490.264 無243(75.94)216(72.00)

2.3 rs1045411G/A位點的遺傳模型與肺結核易感性之間的關聯 rs1045411G/A 位點的共顯性模型中，與 GG 基因型相比，AG 基因型(OR=1．447，95%CI：1．025～2．041，P=0．035)和 AA 基因型(OR=2．812，95%CI：0．985～8．033，P=0．045)與肺結核的易感性相關；rs1045411G/A 位點的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也與肺結核的易感性相關(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)；而在rs1045411G/A位點的隱性模型中[(AG+GG) vs AA]，以及在rs1045411G/A 位點的超顯性模型中[AG vs (GG+AA)]，病例組和對照組間差異無統計學意義(均P>0．05)，見表5。

表3 結核組和對照組的等位基因分布[例(%)]

注：兩組間三個位點等位基因分布均符合H-W平衡(P>0.05)

表4結核組和對照組的基因型分布[例(%)]

Table4Genotype distribution in tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

SNPs基因型病例組(n=320)對照組(n=300)χ2Prs1412125 A/GAA191(59.69)190(63.33)0.9890.610AG110(34.37)92(30.67)GG19(5.94)18(6.00)rs1045411 G/AGG196(61.25)212(70.67)7.5870.023AG111(34.69)83(27.67)AA13(4.06)5(1.66)rs2249825 C/GCC222(69.37)227(75.67)3.0740.215CG91(28.44)68(22.67)GG7(2.19)5(1.66)

2.4 連鎖不平衡分析 rs1412125A/G與rs2249825C/G 之間 D′與r2分別為(0．24，0．30)；rs1412125A/G 與rs1045411G/A 之間 D′與r2分別為(0．53，0．22)；rs2249825C/G 與 rs1045411G/A之間 D′與r2分別為(0．37，0．10)。見圖1。

圖1 HMGB1 3個SNPs的連鎖不平衡分析

Figure1Analysis on linkage disequilibrium of three SNPs of HMGB1

表5 rs1045411G/A 位點不同遺傳模型與肺結核易感性的關聯[例(%)]

3 討論

肺結核是由 MTB引起的慢性肺部疾病，僅5%～10%的 MTB感染者會發展成具有臨床癥狀的疾病，多達90%的感染者為無癥狀感染[1-2]，因此，應重點關注宿主的個體易感性。近年來，肺結核易感基因位點的多態性已經成為研究熱點，研究[10]證明遺傳因素與結核的感染和易感性密切相關。Mishra等[3]發現 CCL5的-403G>A SNPs 與 PTB 易感性存在顯著關聯。Curtis等[4]發現 ASAP1基因的SNPs與俄羅斯人群中 TB 的易感性相關。Li等[5]發現IFNG 基因rs2069718 TT 基因型與肺結核感染期間中的保護作用相關。因此，候選基因的選擇和其多態性位點的檢測一直被認為是 TB預防和治療的突破。

HMGB1是一種存在于真核細胞內的非組蛋白染色體結合蛋白。HMGB1在細胞內外發揮多種作用，如免疫應答，DNA 修復，染色質穩定化，細胞凋亡和基因轉錄。HMGB1作為晚期炎癥介質在腫瘤和各種炎癥性疾病的發病機制中發揮關鍵作用[6-8]。與此同時，HMGB1在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌、哮喘等慢性肺部疾病中有較高水平表達[10-13]，表明 HMGB1可能作為一種晚期促炎細胞因子參與肺部相關疾病的發病過程。肺結核患者體內的許多固有免疫細胞，如巨噬細胞、單核細胞是產生HMGB1的主要細胞[14]。HMGB1在肺結核組織和血清中表達升高，表明 HMGB1可能參與抗結核反應，并且可以一定程度上反映組織的損傷程度[9]。但目前尚未發現 HMGB1基因多態性與肺結核易感性有相關性的報道。因此，本研究是對 HMGB1基因多態性與豫北地區肺結核易感性的相關性首次探討。

在本研究中，通過對HMGB1 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個位點SNPs基因分型來檢測HMGB1基因多態性與 PTB 易感性的關聯。研究發現，+1177G/A位點A等位基因可增加患肺結核的風險(OR=1．485，95%CI：1．110～1．986，P=0．007)。進一步研究發現，+1177G/A 基因型分布在結核組和對照組間差異具有統計學意義(P=0．023)，AG 基 因 型 (95%CI：1．025～2．041，P=0．035)發生肺結核風險是 GG 基因型的1．447倍，AA 基因型(95%CI：0．985～8．033，P=0．045)發生肺結核風險是 GG 基因型的2．812倍。這些數據表明rs1045411(+1177G/A)位點多態性與肺結核的易感性相關?；?’側翼區域的多態性可以控制基因表達，rs1045411(+1177G/A)多態性位于3’側翼區域，因此可能影響HMGB1基因的表達[8]，rs2249825(+3814C/G)多態性雖位于內含子1中，但可能會影響v-Myb的結合位點，這被證明是HMGB1表達的強有力的增強子[15]，但在本研究中未發現rs2249825多態性與肺結核的易感性相關，rs1412125(-1615A/G)位于 HMGB1上游-1615堿基對，它可能與人類切割的同源域結合，后者在抑制轉錄中起作用并起到轉錄抑制因子的作用[16]；然而，該 SNPs也未發現與肺結核的易感性相關。為了找到最理想遺傳模型，本研究建立了rs1045411(+1177G/A)基因多態性的共顯性、顯性、隱性和超顯性模型。在rs1045411(+1177G/A)位點的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也發現可以顯著增加患肺結核的風險(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)，而在rs1045411位點的隱性模型和超顯性模型中，結核組和對照組間差異無統計學意義。連鎖不平衡在人類基因組中表達，可以用作遺傳標記定位參與疾病檢測和治療的相鄰變體，然而本次研究的 HMGB1的3個位點未發現連鎖現象(r2<0．8)。

總之，本研究提示rs1045411(+1177G/A)位點多態性與肺結核的易感性顯著相關，同時為肺結核分子水平發病機制的確定提供基礎，這項研究可能會對肺結核的發展和治療提供新的思路。然而這項工作的局限性是缺乏患者的生存數據。因此，HMGB1多態性是否與肺結核患者的生存有關需要進一步檢查。此外，需要包含更多個體的更大型研究來檢查HMGB1多態性在肺結核進展中的功能。