高產油綠球藻GIEC-38轉錄本和基因表達譜分析

馮 佳， 朱順妮， 許 瑾， 王忠銘， 袁振宏,2*

(1.中國科學院 廣州能源研究所;中國科學院可再生能源重點實驗室;廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室, 廣東 廣州 510640； 2.生物質能源河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 鄭州 450002)

化石能源的大量消耗以及所造成的環(huán)境污染，使得大力推進生物質能等可再生能源技術的開發(fā)利用以及多元化、規(guī)模化應用成為重要發(fā)展思路[1-2]，其中開發(fā)應用生物固碳工程和技術配合CO2零排放的能源新技術是重要的發(fā)展方向[3]。微藻以其生長快、適應性強、屬非糧食資源以及CO2零排放等優(yōu)勢成為一種優(yōu)質生物燃料的原料[4-5]。目前高產油藻株篩選方法主要有天然篩選、細胞工程以及宏觀生長因素調控。Zaslavskaia等[6]通過基因工程技術將編碼葡萄糖轉運體的基因引入一種無法進行異養(yǎng)生長的微藻(Phaeodactylumtricomutum)細胞中，使其能在黑暗中利用外源葡萄糖進行異養(yǎng)生長并達到100 g/L的細胞密度。美國有研究機構[7-8]培育多種富含油脂的綠藻，其在培養(yǎng)基缺氮條件下含油脂達40%～66%，是自然條件下油脂含量的3～12倍。但是微藻生長速率與油脂富集之間存在很大的相互抑制，當微藻達到最佳生長速率時，其細胞中油脂含量較低；而人為控制生長條件使微藻單位干質量的油脂含量增加時，微藻的生長速率和太陽能轉化效率則明顯降低[9]。因而在選用天然條件下高產油藻種的基礎上，結合宏觀調控和細胞工程如何獲取高油脂富集力藻株和開發(fā)高產油工藝是關鍵所在。Illumina高通量測序克服了以往研究方法的不足，RNA-Seq方法具有更高的檢測通量和精確度，可對任意物種的轉錄組進行檢測，是轉錄組研究的強大工具[10]，如Boyle等[11]用RNA-Seq方法分析出三酰基轉移酶有助于衣藻Chlamydomonas中TAG的累積。Rismani-Yazdi等[12]運用關鍵酶的編碼基因成功識別出綠藻Dunaliellatertiolecta中參與生物合成的代謝途徑。Cheng等[13]也通過Illumina高通量測序鑒別了菱板藻系統(tǒng)分支以及轉錄本功能分類等，從微觀層面分析研究了油脂富集優(yōu)勢突變藻株的代謝機理。國內外關于綠球藻的研究分析非常少，因此很有必要對綠球藻進行微觀層面的剖析。本研究選用天然條件下生長好且含油高的綠球藻GIEC-38作為研究對象，利用Illumina高通量測序RNA-Seq方法對細胞內轉錄本進行測定，分析了轉錄本的功能并對代謝通路和基因表達譜進行注釋。同時通過缺N培養(yǎng)提高細胞油脂含量并對比細胞表達譜分析基因表達差異，以期探索發(fā)現N脅迫對于細胞微觀代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 藻株及培養(yǎng)基

綠球藻GIEC-38(Chlorococcumsp.)，中國科學院廣州能源研究所生物質能生化轉化實驗室分離純化所得。BG-11培養(yǎng)基：1 500 mg NaNO3、40 mg K2HPO4·3H2O、75 mg MgSO4·7H2O、3 mg 檸檬酸、3 mg 檸檬酸鐵銨、36 mg CaCl2·2H2O、200 mg NaHCO3、1 mg MgNa2EDTA·H2O、1 mL微量元素和999 mL去離子水。微量元素溶液的主要成分為100 mL蒸餾水中含286 mg H3BO3、181 mg MnCl2·4H2O、22 mg ZnSO4·7H2O、8 mg CuSO4·5H2O、39 mg Na2MoO4·2H2O和5 mg Co(NO3)2·6H2O。所有用于測量的藻細胞培養(yǎng)時均通入1% CO2，放置在恒溫(25±2)℃、光照強度5 000 lx、光暗比24 h∶0 h的柱狀氣升光生物反應器中。

1.2 Bligh-Dyer改進方法測定細胞油脂

取適量干藻粉(0.1 g)于10 mL離心管中，加入1 mL氯仿、2 mL甲醇和0.8 mL去離子水，在35 ℃搖床上反應30 min后將樣品在7 000 r/min下離心5 min，然后將液相部分移至50 mL離心管中，再次加入1 mL氯仿、2 mL甲醇和0.8 mL去離子水至固相殘渣中，重復上述反應步驟直至萃取液澄清無色后收集所有離心后的液體，加入一定體積氯仿和一定體積水，靜置分層，取下層部分利用離心濃縮儀或者烘箱烘至質量恒定，即得生物油，計算藻體的油脂含量，計算公式為w(油脂)=m(油脂)/m(藻粉)×100%。

1.3 轉錄組的測定、拼接和注釋

離心收集對數期生長的藻細胞提取總核糖核酸(RNA)[13]，逆轉錄酶反轉合成互補堿基序列的脫氧核糖核酸(cDNA)并補平，擴增后回收進而用TBS380定量后在cBot上橋式擴增，生成簇，利用Illumina Hiseq4000測序平臺進行2×151 bp測序實驗。原始測序數據經過過濾，去冗雜后得到高質量的測序數據。采用Trinity de novo assembler[14]進行序列拼接。使用BLAST程序進行非冗余蛋白數據庫(nr)比對相似度可靠性(E值<10-5)并選取最佳注釋。使用Blast2Go軟件按分子功能、細胞組分、生物過程對序列基因本體(GO)信息進行分類。根據KEGG基因組、生物通路、疾病、藥物和化學物質之間聯系的集成數據庫注釋的基因功能信息對基因參與的代謝通路進行分析。

1.4 差異表達譜測定

表達統(tǒng)計軟件RSEM得到基因的表達量后通過edgeR軟件對統(tǒng)計出的片段進行均一化并計算表達差異，其判斷標準為表達量變化大于2倍，錯誤發(fā)現率(FDR)小于1%。采用goatools 軟件[15]的GO功能對基因和蛋白的功能進行限定和描述、KOBAS軟件[16]對代謝通路的顯著性富集進行分析，使用Fisher精確檢驗進行計算、采用BH方法進行多重檢驗以控制計算的假陽性率，當經過校正的P值≤0.05時認為此功能顯著富集。

2 結果與討論

2.1 綠球藻GIEC-38富集油脂能力

將GIEC-38分別于完全缺氮的BG-11培養(yǎng)基(不含NaNO3)和缺氮的BG-11培養(yǎng)基(NaNO3質量濃度0和0.5 g/L)中培養(yǎng)12天，原始藻株的油脂質量分數為29.67%，在完全缺N的條件下菌種油脂質量分數大幅提高，可以達到50.29%，而在相對缺N的條件下，NaNO3質量濃度0.5 g/L時，藻株不僅生長較快同時細胞富集油脂的能力也有大幅提高，其油脂產量每天可以達到105.50 mg/L，這說明在N缺乏條件下GIEC-38可以大量富集油脂。為了深入探索和解釋GIEC-38油脂產量高的原因，將GIEC-38進行轉錄組測序以及基因表達譜的測定，從微觀層面探究細胞內部的代謝機理，同時對比原始藻株和完全缺N培養(yǎng)下的藻株兩者基因表達和代謝通路的差異，從分子生物角度出發(fā)對N源的改變對細胞造成的影響進行分析和解釋。

2.2 轉錄組測序、拼接和注釋的對比

將GIEC-38進行Illumina測序共產生84 234 706條序列數，經過除雜和去冗余后，進行拼接共得到74 605條轉錄本，長度201～31 026 bp不等，平均長度為841.25 bp；獲得65 984個基因，平均長度為743.79 bp。為了獲得這些基因的注釋，采用NCBI_NR非冗余蛋白庫為綜合數據庫進行對比，查看本物種轉錄本序列的同源序列以及其功能信息，采用E值為10-5作為篩選比對結果的閾值，其中20 952條得到注釋，最相似序列統(tǒng)計結果見表1，由表1可知GIEC-38基因與藻類、細菌以及動植物相關等多種物種存在相關性，這表明GIEC-38可能包含了多種來源的基因[17]，其中與團藻Volvoxcarteri相似度最高為16.97%，其次與萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii相似度為15.04%。

表1 GIEC-38轉錄本NCBI非冗余蛋白庫BLAST最相似分析

為了進一步獲得轉錄組基因的功能，利用Blast2GO軟件中GO數據庫對于一個或一組基因按照其參與的生物過程、細胞成分以及分子功能3個方面進行分類注釋，結果如表2所示，通過GO注釋可以獲得基因背后所代表的生物學意義進而了解GIEC-38全部基因產物的分類情況。

表2 GIEC-38轉錄本GO功能分類統(tǒng)計

續(xù)表2

功能分類functional classification序列條數sequence numberGO生物過程biologicalprocess生長growth840040007信號signaling2300023052生物過程的負調控negative regulation of biological process1150048519代謝過程metabolic process46860008152生物調節(jié)biological regulation8700065007免疫系統(tǒng)過程immune system process650002376生殖過程reproductive process1280022414生物過程調節(jié)regulation of biological process8160050789建立定位establishment of localization8170051234細胞成分組織或生物合成cellular component organization or biogenesis7940071840節(jié)律過程rhythmic process190048511細胞死亡cell killing10001906刺激反應response to stimulus11860050896生物粘附biological adhesion70022610運動locomotion260040011定位localization8430051179

在生物體內，基因并不是獨立存在獨立作用的，不同基因產物之間是通過有序的相互協(xié)調來進行生物學功能的，為了獲得GIEC-38細胞內基因的生物功能，利用KEGG數據庫進行代謝通路的富集分析，共得到344條代謝途徑，分布在細胞代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程和有機系統(tǒng)這5個分支，其中包含基因和轉錄本數目最多的前20個通路如表3所示，核糖體、蛋白質、核苷酸、RNA、碳固定、光合作用以及脂代謝等通路都非常活躍。

表3 GIEC-38細胞中包含基因和轉錄本最多的前20個代謝通路

2.3 缺氮條件下GIEC-38基因差異表達

為了確定沒有氮源的培養(yǎng)基對GIEC-38生長的影響，分別提取對數期原始藻株和完全缺氮培養(yǎng)藻株的RNA進行Illumina測序，過濾低質量的轉錄本后分別獲得91 657 172條和80 363 364條序列，采用對比軟件Bowtie通過與轉錄組對比獲得注釋的分別有79 593 640和69 176 164條序列，占比86.84%和86.08%。

通過軟件edgeR對RSEM得到的數據進行差異表達計算，以原始藻株作為對照發(fā)現在缺N培養(yǎng)基中培養(yǎng)的藻細胞內有14 817個基因表達上調、15 282個基因表達下調，其中有868個基因顯著上調、1 157個基因顯著下調，采用顯著性閾值標準為FDR≤0.05并且log2|FC|≥1。對差異表達基因按照生物學過程、構成細胞的組分以及實現的分子功能進行GO注釋，結果表明GO的注釋遍布41個分支，可能影響著細胞碳水化合物、蛋白質和脂質的合成中酶的表達，使得在缺氮的條件下細胞朝著脂質合成的方向進行。

對表達量有差異的基因進行KEGG pathway富集分析發(fā)現71條代謝通路發(fā)生變化，分布在環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細胞過程、有機系統(tǒng)和代謝過程這5個分支。其中具有顯著性差異的22條代謝通路如表4所示，可以看出，這些代謝通路與碳水化合物、蛋白質的合成、細胞的生長密切相關。

表4 缺N培養(yǎng)條件下GIEC-38細胞中差異表達基因KEGG顯著富集前22代謝通路

從變化顯著的代謝通路中分析其基因表達量的變化發(fā)現，細胞中參與光合作用的多種基因發(fā)生了明顯的變化，而其光合作用碳反應中重要的羧化酶核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)表達量下調2倍，這直接導致GIEC-38在缺N時細胞生物質積累有所減少。三羧酸循環(huán)是機體將糖或其他物質氧化而獲得能量的最有效方式，同時也是糖、脂和蛋白質三大類物質代謝與轉化的樞紐。三羧酸循環(huán)的中間產物，如草酰乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乙酰CoA等是合成糖、氨基酸、脂肪等的原料。氧化磷酸化位于糖酵解和三羧酸循環(huán)之后，是產生能量來源ATP的主要步驟。這些代謝通路中發(fā)現一些與中間產物合成相關基因表達量增加，這些產生的中間產物為脂肪酸的合成提供了大量原料，有利于細胞油脂的積累。另外，在和脂類代謝相關的幾個通路中基因的表達也發(fā)生了一些變化。經研究表明催化脂肪酸鏈合成的限速酶乙酰輔酶A羧化酶表達量上升了約3 倍、催化還原反應的β-酮脂酰-ACP還原酶和烯脂酰-ACP還原酶I表達量分別是原來的3.5和1.8倍、催化第一步縮合反應的β-酮脂酰-ACP合酶I表達量上調了4.4倍、催化酶β-酮脂酰-ACP合酶表達量上調2倍以上以及中性脂TAG合成過程中1-酰基甘油-3-磷酸-O-酰基轉移酶等蛋白酶的表達量是原來的8倍以上，這些基因表達的變化都推動反應朝著油脂合成的方向進行，使得GIEC-38在缺N條件下油脂質量分數大幅增加。

3 結 論

通過對綠球藻GIEC-38細胞內轉錄本的測定發(fā)現，參與核糖體、蛋白質、核苷酸、RNA、碳固定、光合作用以及脂代謝等通路都非常活躍。通過缺N培養(yǎng)GIEC-38油脂質量分數可達50%以上，細胞中有868個基因顯著上調、1 157個基因顯著下調，分布在41個生物學功能、71條代謝途徑中。其中，與脂類代謝相關酶表達量都有明顯上調，這些促使了細胞脂類的合成，提高了細胞的油脂產量。