益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘水質及細菌群落結構的影響

陳錦豪，鄭錦濱，毛 勇，2，蘇永全，王 軍

(1.廈門大學 海洋與地球學院，福建 廈門 361005； 2.廈門大學 近海海洋環境科學國家重點實驗室，福建 廈門 361005 )

水質優劣是水產養殖成敗的關鍵，優良的水質能夠為養殖生物提供良好的生存環境，直接影響到水產養殖的經濟效益。隨著水產養殖業的快速發展，養殖規模的不斷擴大，尤其是高密度集約化養殖模式的應用，養殖過程中有害污染物的積累嚴重破壞養殖水體生態環境，養殖水域環境質量日益下降，各種養殖疾病頻繁發生，嚴重制約水產養殖業的可持續健康發展。在水產養殖中通常采用化學藥物和抗生素進行養殖環境的改善和病害的控制，但傳統的水處理方法費用高，對生態環境造成不良影響，而且抗生素的長期使用也帶來了一系列負面影響，如細菌耐藥性產生、養殖動物體內抗生素的積累，動物腸道微生物平衡被破壞等[1]。因此，維持良好的水質條件并減少化學藥物和抗生素的使用，是確保水產養殖業可持續健康發展的必然選擇。益生菌具有降解水體中有害物質、凈化水質的功能，且具有成本低、無毒副作用、不污染環境等特點，已被廣泛應用于水產養殖中，并取得良好效果[2]。傳統的養殖實踐中以添加無機氮磷元素或有機糞肥為主，由于營養成分單一，易引起養殖水環境生態環境失調[3]。通過聯合使用益生菌和營養物質提高水質凈化效果和養殖動物品質的研究鮮有報道。本研究通過向魚蝦混養池塘中添加益生菌和復合營養劑對養殖水環境進行生態調控，探討其對養殖池塘水質和細菌群落結構的影響，評價聯合使用益生菌和復合營養劑對養殖水體環境的調控效果，以期為魚蝦健康養殖及改善水體生態環境提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料有機玻璃水樣采集器(1 L)；透明度盤；鹽度計(杭州陸恒生物科技)；GM-0.5A無油隔膜真空泵(天津津騰)；砂芯過濾裝置(1 000 mL)；0.22 μm濾膜；TCBS瓊脂培養基；氨氮檢測試劑盒(廈門利洋水產科技)；亞硝酸氮檢測試劑盒(廈門利洋水產科技)；便攜水質檢測儀(青島邦邦信息科技)。

1.2養殖池塘水質調控方法試驗在3 000 m2的魚蝦混養池塘中進行，混養對象為凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)與黃鰭鯛(Acanthopagruslatus)。凡納濱對蝦苗種[體長(0.6 ± 0.05)cm]來自海南中正水產科技有限公司，放苗數15萬尾；黃鰭鯛為福建省詔安縣養殖戶的標粗苗，放養規格為2～4 cm，放苗密度為62～94尾·hm-2。本實驗使用的益生菌為商品化復合益生菌制劑調水先鋒(廈門欣藍瑞生物科技有限公司，含酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細菌、硝化細菌等，有效活菌含量60億個·mL-1以上),復合營養劑為氨基酸肽肥(廈門欣藍瑞生物科技有限公司,含氨基酸、多肽、氮、磷、鉀和微量元素等)。方法如下：復合益生菌制劑和復合營養劑各10 L，全池潑灑，7 d 1次。

1.3養殖池塘水質測定方法每日上午10:00測定養殖池塘的溫度、鹽度、pH、溶解氧、透明度，每3 d檢測1次氨氮、亞硝酸鹽、弧菌數。測定方法：使用便攜水質檢測儀測定池塘水下約20 cm處溫度、pH和溶解氧；使用有機玻璃水樣采集器采集水下20 cm的池水，使用鹽度計測定鹽度；使用黑白盤法測定池水透明度，具體方法為將黑白盤緩緩放入池中，至看不見白盤后，記錄第1次讀數，繼續下沉黑白盤至看不見的深度，再緩緩將其拉起，至看見白盤后，記錄第2次讀數，2次讀數的平均值即為池水透明度；池塘內分別設置5個采樣點(池塘四角和中央)，采集水下20 cm水樣，混勻，使用氨氮試劑盒、亞硝酸氮試劑盒，參照試劑盒說明書測定相應水質參數；使用滅菌海水將采集的水樣稀釋10倍，取100 μL涂布于TCBS瓊脂培養基平板上，設置3個平行組，30 ℃恒溫培養24 h后，記錄弧菌數。

1.4水體細菌群落結構分析

1.4.1 樣品采集當養殖池塘水色穩定時(茶褐色)，于池塘內設置5個采樣點，用1 L的采水器分別采集水樣(水下20 cm)，將水樣等量混合后取1 L，0.22 μm濾膜抽濾，所得濾膜即為所需樣品，-80 ℃保存待測。

1.4.2 樣品測序運用Illumina HiSeq2500測序平臺，構建小片段文庫進行雙末端(Paired-End)測序，對養殖水體細菌微生物16S rRNA V3-V4區(基因的2個高變區)進行多樣性測序分析(水體細菌微生物多樣性分析由美因生物科技有限公司完成)。

1.4.3 測序數據處理與分析測序得到的原始下機數據(Raw reads))經過拼接、過濾，得到Clean Tags，Clean Tags經過嵌合體的去除得到有效數據(Effective Tags)，基于質控合格的有效數據進行后續生物信息分析：根據特定的閾值(默認選取97%)進行OTU聚類，結合微生物目前最權威的數據庫——SILVA數據庫進行物種注釋和物種分類分析。根據物種注釋結果，選取樣本在門、綱、目、科、屬 5個分類級別上最大豐度排名前 10 的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，并得到樣品OTU數量統計結果。測序分析流程見圖1。

2 結果與分析

2.1養殖水體理化因子和弧菌濃度變化試驗期間養殖池塘水溫、鹽度、pH、溶解氧、透明度、氨氮、亞硝酸鹽和弧菌濃度的變化范圍分別在(26.37±1.94)℃，(28.44±1.04) mg·L-1，(8.32±0.33) mg·L-1，(8.22±3.48) mg·L-1，(22.23±3.57)cm，(0.2±0.09)mg·L-1，(0.06±0.04)mg·L-1，4×102～35×102cfu·mL-1(表1)。添加益生菌和復合營養劑后，養殖水體透明度增大，且維持在(22.66±2.88)cm。養殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽濃度分別在實驗后期(25 d)和中期(10 d和16 d)有所升高，但均在養殖魚蝦適宜范圍內(表1)。添加益生菌后養殖水體中弧菌濃度在試驗前期和中期(1～19 d)總體呈下降趨勢，后期(22～25 d)恢復至起始濃度(表1)。

表1 水質指標檢測結果

注：第6～9天，天氣悶熱、無風，故DO較低

Note: Low DO was due to the fact that it was hot without wind on days 6-9.

2.2細菌多樣性分析

2.2.1 高通量測序數據水體樣品經Illumina HiSeq2500平臺測序后得到下機數據Raw PE共114 397條，經過拼接和質控后得到103 384條Clean Tags，經過嵌合體過濾后得到102 842條Effective Tags，堿基質量值Q30比例大于93.00%。使用USEARCH方法，對樣品的Effective Tags進行聚類，以97%的一致性，將水樣所得的序列聚類成OTU，本實驗得到的OTU數目為1 878。以OTU中出現頻數最高的序列為該OTU代表序列；利用OTU代表序列進行分類注釋，采用算法為UCLUST算法，考序列為Silva數據庫，分類水平為界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)；根據注釋情況，統計樣品注釋到各個分類水平上的序列數目，樣品在界、門、綱、目、科、屬、種上的OTU數目分別為4，43，79，91，652，952和16，其中，注釋到屬的OTU數目所占比例超過50%，說明樣本OTU注釋效果好。測序數據質控結果統計如表2所示。

表2 測序數據質控結果

注： Raw PE-Reads：原始下機的PE-Reads數目；Raw Tags：拼接得到的Tags序列；Clean Tags：Tags過濾低質量和短長度Tags后的序列；Effective Tags：過濾嵌合體后，最終用于后續分析的Tags序列；Effective Rate：Effective Tags占Raw PE-Reads的比例； Avg Length：Effective Tags的平均長度； Q30contont：Effective Tags中堿基質量值大于30(測序錯誤率小于0.1%)的堿基所占的百分比

Note: Raw PE-Reads: The number of PE-Reads from the original machine; Raw Tags: Tags sequences obtained by splicing; Clean Tags: The sequence that filter the low quality and short length Tags; Effective Tags:Tags sequence that are finally used for subsequent analysis after filtering the chimera; Effective Rate(%): The proportion of Effective Tags in Raw PE-Reads; AvgLength: The average length of Effective Tags; Q30content: The percentage of bases that the quality of base is greater than 30 ( The sequencing error rate less than 0.1%) in the Effective Tags

2.2.2 物種相對豐度水體中的優勢菌門為藍細菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)，其相對豐度分別為38.19%，28.11%，18.85%，12.85%，0.76%，0.37%和0.08%；優勢綱藍細菌綱(Cyanobacteria)、α-變形菌(Alphaproteobacteria)、放線細菌綱(Actinobacteria)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、擬桿菌綱(Flavobacteriia)的相對豐度分別為36.39%，24.87%，8.95%，8.85%，7.47%和4.86%；優勢目SubsectionI、紅細菌目(Rhodobacterales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、微球菌目(Micrococcales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)的相對豐度分別為36.21%，22.22%，8.95%，7.88%，7.47%和4.86%；優勢科FamilyI、紅細菌科(Rhodobacteraceae)、酸微菌科(Acidimicrobiaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)的相對豐度分別為36.21%，22.22%，8.68%，7.87%，7.19%和3.59%；優勢屬原綠球藻屬(Prochlorococcus)、Marivita、聚球藻屬(Synechococcus)、CandidatusAquiluna、Phaeodactylibacter的相對豐度分別為27.46%，8.05%，7.95%，5.05%和4.54%。從養殖水體中鑒定到的主要益生菌為紅螺菌科(Rhodospirillaceae)細菌、蛭弧菌屬(Bdellovibrio)細菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌、乳桿菌屬(Lactobacillus)細菌，其相對豐度分別為0.09%，0.002%，0.006%和0.02%。

3 討 論

本研究通過聯合使用益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘進行生態調控，結果表明，該調控方式能夠維持養殖水環境pH、溶解氧、透明度、氨氮、亞硝酸鹽和弧菌濃度等重要水質指標在養殖魚蝦適宜范圍內。細菌群落結構分析表明，添加益生菌和復合營養劑后，養殖水體中細菌多樣性水平較高，含有紅螺菌科(Rhodospirillaceae)細菌、蛭弧菌(Bdellovibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌與乳桿菌屬(Lactobacillus)細菌等水產養殖中的常見益生菌，為養殖水產動物創造良好的生態環境。試驗前期，筆者通過走訪調查，發現本研究中的魚蝦混養在養殖的過程中水色較為穩定，故對其進行研究，分析其細菌群落結構，為后續益生菌的篩選和鑒定奠定基礎，故未設置對照組。

3.1添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘pH值的影響pH值不僅是海水水質的重要指標，同時也影響著水生生物一系列代謝活動，是反映水質是否適合魚蝦生存的依據。水產養殖中pH的適宜范圍為6.5～9，魚蝦最適宜的范圍是7～8.5[4]，而海水養殖品種的適宜pH一般在7.5～8.5，其中黃鰭鯛的最適pH為7.5～8.6[5]，凡納濱對蝦的最適pH為7.7～8.6[6]。pH值過高或過低，都會對養殖生物造成不同程度的損害，甚至死亡。本試驗中養殖水體pH的范圍在7.8～8.7之間，適合黃鰭鯛和凡納濱對蝦的養殖，這與李斌等[7]關于生物絮團對水質調控作用的研究結果相似，在添加微生態制劑后，其各試驗組pH變化范圍在7.9～8.5之間，表明添加益生菌和復合營養劑能夠穩定水體pH，起到改善水質的作用。

3.2添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘溶解氧的影響溶解氧(Dissolved Oxygen，DO)影響著養殖動物的攝食量、餌料系數、抗病力等[8]，同時也是判定養殖池塘水質好壞的重要指標之一。研究結果表明[9]，魚蝦類養殖水域溶解氧應保持在5～8 mg·L-1，過高或過低的溶解氧都會影響到養殖動物的生長、發育。

3.3添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘透明度的影響透明度是表示光透入池塘水中深淺的程度，是池塘養殖水質的重要度量參數之一。文獻[10-11]研究結果表明，在池塘養殖中，池水透明度的適宜范圍在25～40 cm，透明度過高或過低，說明水體過清或過肥，均會影響養殖生物的正常生長。本試驗中，添加益生菌和復合營養劑后，養殖水體透明度維持在22.66±2.88，適合黃鰭鯛和凡納濱對蝦的養殖。

3.4添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘氨氮濃度的影響氨是水體中各種生物蛋白質代謝的重要終產物，并且氨可以通過細菌的硝化作用被氧化為亞硝酸鹽，水中一定量的氨氮及亞硝酸鹽含量都會對魚蝦的健康造成影響，故而氨氮、亞硝酸鹽是衡量養殖水質的重要標準[12]。據研究報道，黃鰭鯛養殖池塘中氨氮應低于0.5 mg·L-1，亞硝酸鹽低于0.3 mg·L-1[5]，凡納濱對蝦養殖池塘中氨氮應低于0.6 mg·L-1，亞硝酸鹽應低于0.2 mg·L-1[13]。過高的氨氮及亞硝酸鹽濃度都會對養殖動物造成不同程度的危害。當氨氮含量高于0.2 mg·L-1時，會使養殖動物出現慢性中毒或急性中毒，慢性氨氮中毒主要表現為攝食強度降低，生長受阻，組織損傷，降低了氧在組織間的運輸；急性氨氮中毒表現為養殖動物行動亢奮，在水中失去平衡能力，嚴重者死亡[14-15]。亞硝酸鹽是氨轉化為硝酸鹽過程中的中間產物，當轉化過程受到阻礙，中間產物的亞硝酸鹽就會在水體中積累，對魚蝦的毒性較強[9]。當亞硝酸鹽含量高于0.2 mg·L-1時，養殖的水生動物表現厭食、游動緩慢、反應遲鈍、呼吸急促、時常到水面上呼吸、體色深暗及鰓絲暗紅[14]；研究表明，一定質量的亞硝酸鹽會使養殖動物血液中的血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白，血液載氧能力下降，造成動物缺氧，甚至窒息死亡，尤其對血藍蛋白載氧能力的破壞被認為是其對蝦類產生毒性的主要機制之一[14,16]。宋協法等[17]報道了添加益生菌對半滑舌鰨養殖水質及仔稚魚生長的影響，結果表明，添加益生菌與復合營養劑能夠使養殖水體pH、氨氮和亞硝酸鹽維持在適宜范圍。鄒文娟等[18]研究結果表明，添加光合細菌與枯草芽孢桿菌對污水中氨氮、亞硝酸鹽的降解效果較好，氨氮與亞硝酸鹽的降解率分別達到了86.13%與71.96%。謝永斌等[3]的研究發現，添加益生菌與復合營養劑能夠明顯降低水中氨氮及亞硝酸氮含量[氨氮(0.17±0.1) mg·L-1；亞硝酸氮(0.07±0.00)mg·L-1]，對水環境具有較好的改善作用。聶偉[19]報道了添加由絮凝活性菌株培育的生物絮團對水質的影響，結果表明，添加由枯草芽孢桿菌培育的生物絮團能顯著降低水中氨氮及亞硝酸鹽含量[氨氮(0.14±0.05)mg·L-1；亞硝酸鹽(0.055±0.012)mg·L-1]，起到凈化水質的作用。本研究中，通過向魚蝦混養池塘中添加益生菌和復合營養劑，使養殖水體中氨氮及亞硝酸鹽的變化范圍分別在(0.2±0.09)mg·L-1與(0.06±0.04)mg·L-1之間，維持在黃鰭鯛和凡納濱對蝦養殖的適宜范圍內。

3.5添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘弧菌濃度的影響在水產養殖過程中，弧菌是一種常見的細菌，部分弧菌能夠降解養殖水體中的有機物，對水質的凈化具有積極的意義，但在導致養殖水產動物感染的病原菌中，致病性弧菌占有較高比例，不僅給水產動物健康帶來高風險，也給海水養殖產業造成嚴重的經濟損失。在本試驗中共檢測到羅尼氏弧菌(Vibrioshilonii)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和創傷弧菌(Vibriovulnificus)3種致病弧菌，僅占總細菌微生物的0.06%。研究結果表明，副溶血弧菌的變異種可能是導致凡納濱對蝦養殖過程中“早期死亡綜合征(Early mortality syndrome，EMS)”發病的病原菌，對養殖業危害極大[20]。倪軍等[21]的研究發現，當水中副溶血弧菌接種密度為2.5×104cfu·mL-1時，10 d內對蝦累計死亡率高達98%，接種密度為5.0×103cfu·mL-1時，10 d內對蝦累計死亡率達到72%。本試驗期間養殖水體中副溶血弧菌的濃度范圍為1.0×102～5×102cfu·mL-1，低于上述致死濃度，說明該調控方式能使養殖水體弧菌數量維持在安全范圍內。這可能是由于添加益生菌和復合營養劑后增加了養殖水體中枯草芽胞桿菌的數量，進入水體后能夠通過分泌相關的殺菌物質，如有機酸、抑菌素等，對有害菌起到一定的抑制作用，從而抑制了病原菌的生長[22-23]。

3.6添加益生菌和復合營養劑對魚蝦混養池塘細菌群落結構的影響對添加益生菌和復合營養劑后魚蝦混養池塘細菌群落結構的分析表明，水體中相對豐度占主要優勢的細菌微生物是藍細菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)，占總細菌微生物的98%以上，為水體菌群主要組成成分[24-25]；其中，藍細菌們細菌數量最多，占總細菌微生物的38.19%，厚壁菌門細菌僅占總細菌微生物的0.08%，這與鄭佳佳等[26]關于復合益生菌對草魚養殖水體水質和菌群結構影響的研究結果相似，說明添加益生菌打破原有水體的微生態平衡，形成新的優勢種群，改善了水質條件。藍細菌門中，原綠球藻屬(Prochlorococcus)與聚球藻屬(Synechococcus)分別占總細菌微生物的27%與8%，屬于光和細菌，也是海洋微型藍細菌最重要的2個類群，在大洋中分布廣且數量多，是全球海洋初級生產力的主要貢獻者[27]。變形菌門中，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)及蛭弧菌屬(Bdellovibrio)分別占總細菌微生物的24.87%，0.25%，0.09%和0.002%。研究表明，α-變形菌綱和β-變形菌綱對多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)具有降解作用，可以利用PAHs進行生長[28]；紅螺菌科細菌是在水產養殖中主要運用的一類光合細菌，具有凈化水質，促進動物生長、提高動物免疫力和減少動物病害的作用[29-31]；蛭弧菌(Bdellovibrio)能夠在較短的時間內裂解弧菌、氣單胞菌、假單胞菌、沙門菌和志賀菌等常見病原菌，將這些病原菌限制在較低的數量水平，同時又可以有效地控制水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質[32]。放線菌門占總細菌微生物的18.85%，研究結果[33-34]表明，放線菌門中放線菌(Actinomycetes)能夠釋放多種水解酶降解水中有機質來改善水質，且菌體本身營養豐富，從而促進魚蝦生長，保證魚蝦健康；同時，它能夠產生拮抗化合物或競爭生存位點來預防和控制病原菌，以此降低病原菌帶來的危害。Cottrell等[35]研究結果指出，擬桿菌門細菌是海洋中溶解性有機物的主要消費者，能夠降解水體中動物的糞便以及殘留的餌料等有機物。本試驗中，擬桿菌門中的Flavobacteriia綱占總細菌微生物的5%，它能降解海水中高分子有機物，凈化池塘水質，影響著養殖動物的生存情況[36]。海洋環境與土壤環境中廣泛分布著疣微菌門細菌，本試驗中疣微菌門細菌占總細菌微生物的0.76%，目前對該門類細菌生態功能的了解甚少，且多數該門類細菌屬于不可培養微生物[36-37]。綠彎菌門細菌也被稱作綠色非硫細菌(green non-sulfur bacteria)，是細菌界中一個非常多元化的類群，本試驗中該門類細菌占總細菌微生物的0.37%，該門類細菌代謝類型多元化，包括厭氧光合自養菌，能夠通過氧化亞硝酸鹽營化能無機營養，進行硝酸鹽或鐵還原，以及嚴格好氧或兼性厭氧菌，能夠進行還原脫氧營厭氧生長等[38]。厚壁菌門中，芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌與乳桿菌屬(Lactobacillus)細菌是水產養殖中的常用益生菌，分別占總微生物的0.006%與0.02%。研究結果表明，益生芽孢桿菌(Bacillus)可分泌各種消化酶，幫助動物對營養物質的消化吸收，促進生長，同時抑制病原微生物，調節免疫活性及改善水體環境，直接或間接地保護水產動物免受病原菌的感染[39-40]；乳酸桿菌(Lactobacilli)可通過產生抗菌物質或通過競爭營養或腸道黏附位點來抑制致病菌，通過誘導黏付素的分泌或阻止細胞凋亡而增強腸道的屏障功能，從而保護腸道并增強動物機體免疫力及抵抗力[41-42]。