非洲楝擬莖點霉葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性的測定

林 宇，李增平，吳如慧，張 宇

(海南大學 熱帶農林學院，海口 570228)

非洲楝[Khayasenegalensis(Desr.) A. Juss]又稱非洲桃花心木、塞內加楝、塞楝等，是主要的熱帶速生用材樹種,具有重要的經濟價值和生態價值。筆者在海南大學海甸校區內調查發現一些非洲楝的葉片發生較嚴重的葉斑病，通過鏡檢初步診斷為擬莖點霉屬真菌引起的葉斑病，取名為非洲楝擬莖點霉葉斑病。擬莖點霉屬(Phomopsis)的有性態為子囊菌門的間座殼屬(Diaporthe)，常引起多種植物的葉斑病，也可為害茄子果實引起褐紋病等[1]。非洲楝在我國目前已報道的病害有立枯病(RhizoctoniasolaniKühn)、 炭疽病(Colletotrichumsp. )、葉點霉葉斑病(Phyllostictasp.)、葉枯病(Pestalotiasp. )、葉霉病(Alternariasp.)、無根藤寄生(CassythafiliformisL.)以及褐根病(PhellinusnoxisCorner)等[2],中國真菌志——擬莖點霉屬中有楝擬莖點霉[Phomopsisabdita(Sacc.)Traverso]引起的楝樹枝枯病的記載[1]。國內外文獻中尚未見擬莖點霉屬真菌引起非洲楝葉斑病的報道。本研究針對其病原菌進行分離培養、致病性測定、病原鑒定和生物學特性測定，以便為該病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1供試樣本非洲楝擬莖點霉葉斑病病葉樣本采自海南省海口市海南大學校園內發病的非洲楝病樹，將發病的新鮮病葉片樣本帶回實驗室后進行組織分離培養。

1.2供試苗木致病性測定用的苗木為種植于海南大學教學基地內種植1年的非洲楝和大葉桃花心木幼苗。

1.3供試培養基PDA培養基，Czapek培養基，參考方中達[3]《植病研究方法》配制。

1.4菌株分離將采回的新鮮病葉用清水洗凈，參照方中達[3]有關葉部病原真菌分離方法，從病健處剪取大小為5 mm×5 mm的病葉組織塊，經表面消毒后移到PDA平板上，28 ℃的恒溫培養2～3 d后純化，將純化菌株編號為FZL01，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.5致病性測定參照管斌等[4]的接種方法進行接種。選取無病蟲害的待接種植物葉片，先用75%酒精噴霧消毒，待葉片干后，在同一片葉上沿中脈分別用滅菌束針間隔3cm刺出3處傷口，靠葉尖傷口接空白對照、靠葉基的2處傷口接分離菌，重復3次。用滅菌接種環挑取PDA培養基平板培養好的FZL01菌株約1 cm大小的菌絲塊覆蓋在傷口上，對照接空白PDA培養基，覆蓋濕棉花，套上塑料袋進行保濕，第2天去掉塑料袋。定期觀察接種葉片的發病情況并做記錄。

1.6病原菌鑒定

1.6.1 形態鑒定對病斑上長有小黑點的病葉進行徒手切片，在顯微鏡下觀察30個分生孢子器、50個分生孢子形態特征，測量其大小。參考《植物病原真菌學》[5]《中國真菌志》[1]和中國科學院微生物研究所的“中國微生物與病毒主題數據庫”等[6-7]資料進行種類鑒定。

1.6.2 分子鑒定使用 OMEGA Fungal DNA Kit 提取病原菌 DNA。采用通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增 rDNA基因內轉錄間隔區以及特異性引物 EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG) / EF1-986R (5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC)和Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) /Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)擴增翻譯延伸因子和β-tubulin基因的部分序列。PCR擴增后對其產物進行電泳檢測。使用 OMEGA Extraction Kit 試劑盒切膠回收目的片段，純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將獲得的序列在 NCBI 上進行比對分析，并提交序列，對測序后的 r DNA-ITS 和 EF1-α, β-tubulin序列進行序列聯配比較、編輯。利用 MEGA 6.0 軟件用鄰接法(neighbor-joining，NJ)以Diaporthetoxicodendri,D.vaccinii等為外群，構建系統發育樹。

1.7生物學特性測定選長勢一致(培養3 d)的FZL01菌株菌落，用滅菌打孔器在其邊緣打直徑5 mm的圓形菌餅備用，除溫度外其他測定條件均在28 ℃恒溫培養箱培養，除碳、氮源測定外，其他條件所用培養基均為PDA培養基。采用十字交叉法測量菌落直徑。設置條件：(1)在黑暗條件下分別在10，15，20，26，28，30，32，35，40 ℃恒溫培養，每處理重復4次；(2)照明燈為25 w，設置3種光暗條件(24 h照明、24h黑暗、照明∶黑暗=12 h∶12 h)，每處理重復4次；(3)將濕熱滅菌后PDA培養基的pH值調至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11共10個梯度后制平板，接入FZL01菌株菌餅，每處理重復4次；(4)可溶性淀粉、肌醇、蔗糖、甘油、D-山梨醇、甘露醇、α-乳糖、無水葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖作為Czapek培養基中等質量碳源替換蔗糖，并設置不加蔗糖的Czapek培養基作為對照；(5)牛肉浸膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀、L-天門冬酰胺、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨、 硝酸鈣作為Czapek培養基等質量氮源替換硝酸鈉，并設置不加硝酸鈉的Czapek培養基作為對照。每處理重復4次。

1.8數據分析測量的數據用Excel軟件進行數據分析和制表。

2 結果與分析

2.1非洲楝擬莖點霉葉斑病癥狀病害主要在冬春季發生，從葉尖和葉邊緣開始發病，呈現不規則形褐色病斑，病斑邊緣具明顯的褐色線紋，潮濕條件下外圍黑褐色水漬狀，病斑向葉基擴展迅速，導致葉片大面積壞死后脫落，在葉正面或背面長出大量散生的黑色小點(分生孢子器)；干燥條件下病斑中央變灰白色，擴展減慢(圖1)。

2.2致病性測定接種5 d后發現葉片開始發病，出現淺褐色圓斑，邊緣水漬狀，14 d后逐漸形成不規則病斑，邊緣深褐色，在病斑中央長出黑色小點，為該菌的分生孢子器，對照無明顯變化。后期病斑中央部位干枯，部分接種葉片脫落，同一株樹上其他葉片無變化，將患病葉片帶回實驗室進行組織分離，重新分離獲得了與FZL01相一致的菌株，表明該菌株為致病菌。

2.3病原菌形態

2.3.1 形態特征FZL01菌株在PDA培養基上28 ℃條件下培養3.5 d后菌絲長滿皿，生長較快，菌落白色呈絮狀，具有同心輪紋，菌絲較濃密，其背部呈現暗黃色。7 d后觀察菌落生長濃密，菌絲表面形成黑色墨汁狀粘液，22 d后觀察菌落顏色加深呈暗黃色，菌絲聚集形成小黑點，即分生孢子器。病葉上的分生孢子器黑褐色，單個散生，初埋生后突破表皮，扁球形，直徑為153.05～243.04 μm(平均195.34 μm)，高103.19～159.51μm(平均132.87 μm)；分生孢子有α、β兩型，α型分生孢子無色單胞，紡錘形，大小為(7.8～9.27) μm×(2.54～4.02) μm(平均8.40 μm× 3.49 μm)，多具2個油球；β形分生孢子，無色單胞，線形，一端微彎曲，大小為(13.45～16.63)μm×(1.36～1.93)μm(平均15.24μm×1.61μm)(圖2)。其形態特征與擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌相符[2]。

圖1 非洲楝擬莖點霉葉斑病癥狀

2.3.2 分子鑒定經測序，FZL01菌株的rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin序列分別為543 bp(NCBI登錄號為MK050110)、334 bp(NCBI登錄號為MK054238)和491 bp(NCBI登錄號為MK079660)，分別與Diaporthemusigena序列的相似度為98%(rDNA-ITS，AB899788.1)，92%(EF1-α，KC343869.1)和98%(β-tubulin，KC344111.1)。從Gen Bank中選取含模式菌株在內的相關菌株Diaporthemusigena，D.pascoei，D.arecae等菌株的ITS，EF1-α及β-tubulin序列，使用3種序列聯合建樹，進行多重序列比較及系統發育學分析，結果顯示，該菌株的r DNA-ITS，EF1-α和β-tubulin的聯合序列與Diaporthemusigena的同源性達99%，表明該菌株FZL01與Diaporthemusigena的遺傳距離最小，聚為一類(圖3)。結合形態學特征觀察及分子生物學技術鑒定結果，確定引起非洲楝擬莖點霉葉斑病的病原菌為Diaporthemusigena[8]，屬子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼目(Sphaeriales)、間座殼屬(Diaporthe)，其無性態為半知菌類(Imperfect)、腔孢綱(Coclomycetes)、球殼孢目(Sphacropsidales)的擬莖點霉屬(Phomopsis)。

2.4生物學特性

2.4.1 溫度FZL01菌株在15～35 ℃均能生長，在15～28 ℃是隨著溫度升高菌落的直徑也隨著增加，然后逐漸減少，到40 ℃完全停止。菌落在28 ℃長勢最好，表明其最適生長溫度為28 ℃(圖4)。

2.4.2 光照比較3種光照條件下病菌的生長情況，完全光照和完全黑暗條件下長勢良好，菌落大小幾乎相同，無顯著性差異，但與半光半暗長勢具顯著性差導，表明12 h光暗交替可抑制該菌的菌絲生長(圖5)。

2.4.3 pH值在pH為3～10時病菌均能生長，最適病菌生長的是pH值為5，說明在弱酸到中性環境下有利菌絲生長，酸性或堿性過強都會抑制病菌的生長(圖6)。

2.4.4 碳源在碳源測定中,以蔗糖為碳源的菌落長勢最優，以肌醇、甘露醇、甘油為碳源和未加碳源的菌落都是薄而透明，以糖類為碳源的菌落厚薄均勻長勢較好，即病原菌對糖類的利用率優于醇類(表1)。

表1 碳源對菌絲生長的影響

2.4.5 氮源在復合氮源測定中，以大豆蛋白胨為氮源的菌落長勢最優；單一氮源中，以硝酸鈉為氮源菌落長勢最好，但菌落厚薄有差異，有機氮菌落較厚，長勢好而硝酸鹽菌落較薄，然而硝酸鉀厚薄程度與未加氮源的對照菌落相似，近乎透明，表明硝酸鹽不易被病菌吸收利用。氮源的利用能力從強到弱依次為：有機氮>銨態氮>硝態氮(表2)。

表2 氮源對菌絲生長的影響

3 討 論

擬莖點霉屬[Phomopsis(Sacc.)Bubak]是半知菌類、腔孢綱、球殼孢目中的一個重要真菌屬，在分類上多以有性態間座殼屬(Diaporthe) 為屬名鑒定種[8]，其種類多、廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區[4]。擬莖點霉屬也是植物的一種內生真菌，在自然界的大部分植物體內廣泛存在，其代謝產物與植物的一系列生理生化反應都有一定的相關性。近年來隨著對擬莖點霉屬新種及其病害的不斷報道，擬莖點霉屬菌物也引起了人們越來越多的重視[5]。到2005年為止報道該屬寄主植物共74科[6]。主要有柑橘、西番蓮、草莓、楊梅、茄子、天麻、香龍血樹、青麻、田旋花以及鳳梨科、棕擱科和竹芋科等植物[9]。該屬真菌主要侵染植物的葉、枝及果，很少侵染根，且容易從傷口侵入，引起潰瘍、爛莖、根腐、果腐、葉枯、枝枯和樹皮壞死等癥狀[10]。例如由油球擬莖點霉[Phomopsisdiplodinoides(Sacc) Punith]和筒鳳擬莖點(Phomopsisspectabilis)引起鳳梨科植物葉斑病，由棕竹擬莖點霉(Phomopsisrhapidis)引起的棕櫚科植物褐斑病[11]。對于擬莖點霉屬種的生物學特性研究有很多報道。本研究發現引起非洲楝擬莖點霉葉斑病的病原菌為Diaporthemusigena，光暗交替可抑制該菌的菌絲生長；溫度28℃， pH為5，氮源為大豆蛋白胨，碳源為蔗糖時菌絲生長最適，易從傷口侵入。2002 年謝玲等報道廣西芒果褐色蒂腐病菌(Phomopsismangiferae)的最適生長溫度為25 ℃；適宜生長pH為6.0[12]，2013年張居念等報道福建采后龍眼果腐病菌龍眼擬莖點霉(PhomopsislonganaeChi)的最適生長溫度范圍為 25 ℃，12 h光暗交替生長最佳，最適的 pH為 6[13]。2011年牛曉慶等報道油棕葉斑病菌擬莖點霉(Phomopsis sp.)的最適生長溫度為25 ℃；最適 pH 為7.0[14]； 以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源最適合菌絲生長。與本研究的Diaporthemusigena在溫度、pH、碳源,都存在不少差異，推測可能為不同地理來源、不同寄主的同一屬真菌不同種間會存在較大差異所致[13]。另外，擬莖點霉屬真菌較其他種屬的真菌而言，可能對干熱生態環境有著更強的耐受力和適應力，更容易在宿主植物中生長、傳播和蔓延[15]。目前對楝科植物病害的詳細研究還比較少，但是楝科植物其潛在經濟價值需要對其發生的病蟲害等方面進行更詳細的研究，以便在其某一種病害發生時可及時有效地進行生產防治。