酶法輔助提取柳葉蒿揮發(fā)油的研究*

周金沙朱 良徐睿鑫

1（湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410016）

2（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641）

3（長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南長(zhǎng)沙410016）

我國(guó)約有180余種和44個(gè)變種的蒿屬植物（Artemisia L.），其中許多種是中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物，如青蒿、黃花蒿、茵陳、艾蒿等，這些被用來(lái)治療瘧疾、肝炎、高血壓、青紫、過(guò)敏、黃疸、癌癥、炎癥等各種疾病，以及由微生物引起的感染等。

柳葉蒿（Artemisia integrifolia L.）主要分布在我國(guó)大陸北方以及蒙古、俄羅斯等地，是菊科蒿屬的多年生草本植物。柳蒿芽是柳蒿植株地上部分幼嫩的莖葉，其營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)嫩味香，風(fēng)味獨(dú)特。民間流傳柳蒿芽，具有清熱解毒、去火、消炎、利尿等功效，對(duì)于肝硬化及肝炎具有一定的療效和防治作用。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，柳葉蒿精油具有廣譜的抗菌活性，主要成分為氧化單萜，如莰酮（12.65%）、艾蒿酮（11.78%）、桉油精（6.28%）、茴蒿醇（6.56%）等。本試驗(yàn)采用纖維素酶法輔助提取柳葉蒿揮發(fā)油，并利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了酶法輔助提取工藝,為柳葉蒿揮發(fā)油的酶法輔助提取提供數(shù)據(jù)參考和工藝示范，并為柳葉蒿的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

柳葉蒿的地上部分，于2017年10月在中國(guó)山西省五臺(tái)山采集。

恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；pH計(jì)，梅特勒托利多上海有限公司；數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；玻璃反應(yīng)釜，鞏義予華儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

纖維素酶，10 000 U/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油提取

柳葉蒿曬干后粉碎，過(guò)10目篩。稱(chēng)取200 g干粉，裝入5 L燒瓶中，加入蒸餾水，加纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值，在一定溫度下酶解一定時(shí)間后，按2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中方法，水蒸氣蒸餾提取6 h，得到的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉干燥24 h，過(guò)濾，然后密封于棕色玻璃瓶中，在4℃下保存。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

美可以粗略地分為兩個(gè)層次，一種是事物以其外在的感性形式所呈現(xiàn)的感性美；另一種是以其內(nèi)在結(jié)構(gòu)的和諧、秩序而具有的理性美，尤其數(shù)學(xué)之美。

選定好合適的酶后，分別考察加酶量（40 U/g原料 ～160 U/g原料）、pH（4.2～5.6）、酶解溫度（35℃～60℃）、處理時(shí)間（1h～7h）、液料比（5∶1～30∶1）對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交設(shè)計(jì)，選取加酶量、酶解時(shí)間、酶解pH值、酶解溫度為影響因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。通過(guò)測(cè)定各組樣品揮發(fā)油得率，選出最佳工藝條件。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批柳葉蒿粉末3份，按優(yōu)選的工藝進(jìn)行酶解后，加水蒸餾提取，另取同一批的柳葉蒿粉末3份，不酶解直接加水蒸餾提取，分別測(cè)定揮發(fā)油提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 加酶量對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

稱(chēng)取7份200.0 g柳葉蒿粉末，分別加入5 L燒瓶中，每份加入2.0 L蒸餾水搖勻、浸泡，纖維素酶加入量分別為40 U/g原料、60 U/g原料、80 U/g原料、100 U/g原料、120 U/g原料、140 U/g原料、160 U/g原料，控制酶解溫度50℃，溶液pH值為5.0，酶解時(shí)間為4.0 h，考察不同加酶量對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果可見(jiàn)圖1。

圖1 加酶量對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響

從圖1可看出，加酶量低于100 U/g原料時(shí)，柳葉蒿揮發(fā)油提取率隨著纖維素酶加入量的增加而增加；但加酶量超過(guò)100 U/g原料時(shí)，酶解作用的效果不明顯，揮發(fā)油提取率有降低趨勢(shì)。

2.1.2 溶液pH 值對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

稱(chēng)取8份200.0 g柳葉蒿粉末，分別加入5 L燒瓶中，每份加入2.0 L蒸餾水搖勻、浸泡，纖維素酶加入量為100 U/g原料，控制酶解溫度50℃，酶解溶液pH值分別為4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6，酶解時(shí)間為4.0 h，考察酶解溶液pH值對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)圖2。

從圖2可看出，溶液pH值小于4.8時(shí)，柳葉蒿揮發(fā)油提取率隨著pH值的升高而增加；當(dāng)pH值超過(guò)4.8時(shí)，揮發(fā)油提取率有所降低。

2.1.3 酶解溫度對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

圖2 酶解溶液pH值對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響

稱(chēng)取6份200.0 g柳葉蒿粉末，分別加入5 L燒瓶中，每份加入2.0 L蒸餾水搖勻、浸泡，纖維素酶加入量為100 U/g原料，酶解溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，酶解時(shí)間為4.0 h，考察酶解溫度對(duì)揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果可見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響

從圖3可看出，酶解溫度低于50℃時(shí)，柳葉蒿揮發(fā)油提取率隨著酶解溫度的升高而增加；當(dāng)酶解溫度高于50℃時(shí)，揮發(fā)油提取率隨溫度上升而下降。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

稱(chēng)取7份200.0 g柳葉蒿粉末，分別加入5 L燒瓶中，每份加入2.0 L蒸餾水搖勻、浸泡，纖維素酶加入量為100 U/g原料，酶解溫度為50℃，溶液pH值為4.8，酶解時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，考察酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可看出，當(dāng)酶解時(shí)間少于3.0 h時(shí)，柳葉蒿揮發(fā)油提取率隨酶解時(shí)間的增加而增加；在酶解3.0 h時(shí)后，揮發(fā)油提取率趨于穩(wěn)定。

2.1.5 液料比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響

稱(chēng)取6份200.0 g柳葉蒿粉末，分別加入燒瓶中，每份加入不同體積蒸餾水搖勻、浸泡（蒸餾水與柳葉蒿粉末比例為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1），纖維素酶加入量為100 U/g原料，酶解溫度為50℃，溶液pH值為4.8，酶解時(shí)間為3 h，分別考察酶解液料比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酶解液料比對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響

從圖5可看出，液料比少于15∶1時(shí)，柳葉蒿揮發(fā)油提取率隨液料比的增加而增加；當(dāng)液料比超過(guò)15∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率趨于穩(wěn)定。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選出對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率有較大影響的4個(gè)主要影響因素，分別為纖維素酶加酶量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間，采用正交試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)表2，方差分析見(jiàn)下頁(yè)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

從表2可看出，各因素對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率影響的大小次序?yàn)镃>B>A>D，即酶解溫度對(duì)柳葉蒿揮發(fā)油提取率的影響最大，其次為酶解pH值、加酶量，酶解時(shí)間的影響最小。在選定的水平中，各因素最優(yōu)水平為A2B2C2D3，即加酶量為100 U/g原料，酶解溶液pH為4.8，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為4 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，在最優(yōu)提取條件下，柳葉蒿揮發(fā)油的提取率可達(dá)1.17%，高于正交試驗(yàn)的所有結(jié)果；而未經(jīng)酶解處理的柳葉蒿揮發(fā)油提取率僅為0.69%，酶解法輔助提取與未經(jīng)酶解法提取相比，其提取率提高了0.48%。

3 結(jié)論

通過(guò)前期相關(guān)研究可知，柳葉蒿揮發(fā)油有顯著的抑菌功能，而且可以與緩釋劑復(fù)合作為食品用緩釋抑菌劑。本試驗(yàn)采用纖維素酶酶解輔助水蒸餾提取柳葉蒿揮發(fā)油，較同等條件下不加酶處理的提取率提高了0.48%，說(shuō)明該方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步開(kāi)展柳葉蒿保健及藥用方面的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為其揮發(fā)油的規(guī)模化生產(chǎn)提供新工藝。