細辛揮發(fā)油環(huán)糊精包合物制備工藝的正交試驗研究

郭誠誠，高爽，王玉真，謝慧超，馬學梅，容蓉，楊勇，李凌軍

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

細辛為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細辛AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai或華細辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根及根莖。前2種習稱“遼細辛”[1]。根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，細辛被列為上品，“細辛味辛、性溫，主咳嗽、頭痛腦動、百節(jié)拘攣、風濕痹痛、死肌，久服明目，利九竅輕身長年”[2]?，F(xiàn)代研究表明，細辛的成分主要包括揮發(fā)性成分甲基丁香酚、黃樟醚、欖香酯素、細辛醚等以及非揮發(fā)性成分細辛脂素和馬兜鈴酸Ⅰ等[3]。其主要毒性成分為黃樟醚，不僅具有呼吸麻痹作用，而且是毒性較大的致癌物質(zhì)[4]。甲基丁香酚是細辛鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)痛和麻醉的主要藥效成分，而且也是含量最高的成分[5-6]，可作為藥材細辛的品質(zhì)評價指標[7]。揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣中易揮發(fā)，且易氧化變質(zhì)，使得制劑在制備和儲存過程中因揮發(fā)油的不穩(wěn)定性而變質(zhì)[8]，故用β-環(huán)糊精包合可增加穩(wěn)定性，提高生物利用度，并使揮發(fā)油固體粉末化，便于運輸、儲存和使用，提高療效[9-10]。

本試驗以甲基丁香酚包合率、載藥率及收得率的綜合評分作為衡量包合物優(yōu)劣的指標[11]，通過正交設計優(yōu)選了最佳包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限限公司)；Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱(瑞典Kromasil公司)；FA200AB型電子天平(賽多利斯有限公司)；H01-1A恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表有限公司)；KQ-250E超聲清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；飛鴿TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設備有限公司)。

1.2 試藥

甲基丁香酚標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號111642-200301)；細辛(濟南禾寶中藥材有限公司，批號16050202，生產(chǎn)日期2016.05.02)，產(chǎn)自遼寧，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt.var.mandshuricum( Maxim. )Kitag.的根莖；無水硫酸鈉；β-環(huán)糊精(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20160308)；甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 大孔樹脂富集純化細辛揮發(fā)油

2.2 HPLC方法學考察

2.2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫:30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長282 nm；進樣量20 μL；以甲醇為流動相A，純水為流動相B，梯度洗脫(0～20 min，60%A→65%A；20～30 min，65%A→100% A；30～35 min，100%A→100%A；35～35.1 min，100%A→60%A；35.1～45 min，60%A→60%A)。對照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram

2.2.2 甲基丁香酚對照品溶液制備

精密稱取甲基丁香酚標準品100.05 mg置于100 mL容量瓶，加甲醇溶解稀釋定容至刻度，搖勻，制成甲基丁香酚質(zhì)量濃度為1.000 5 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱取揮發(fā)油包合物0.5 g，置錐形瓶內(nèi)，加入25 mL甲醇，超聲60 min脫包合，抽濾，取續(xù)濾液1 mL置10 mL容量瓶內(nèi)，甲醇定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，可得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察

精密移取對照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL，分別置10 mL容量瓶內(nèi)，甲醇稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過，按照2.2.1項下色譜條件測定。以峰面積為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制甲基丁香酚的標準曲線。結果表明，甲基丁香酚回歸方程為y=17 642x+13.032，R2=0.999 3，在0.500 3 μg/mL～5.002 5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的積分值呈良好的線性關系，見圖2。

圖2 甲基丁香酚標準曲線Fig. 1 Standard curve of methyl eugenol

2.2.5 精密度試驗

取甲基丁香酚標準品溶液，照2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果甲基丁香酚平均峰面積為2 613.30，相對標準偏差為0.19%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h，照2.2.1項下色譜條件測定，結果甲基丁香酚平均峰面積為6 693.70，相對標準偏差為0.22%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2.2.7 重復性試驗

制備供試品溶液6份，照2.2.1項下色譜條件測定，結果甲基丁香酚平均峰面積為2 225.95，相對標準偏差為0.15%(n=6)，表明該樣品處理方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率考察

精密移取已知甲基丁香酚含量的供試品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶內(nèi)，精密加入甲基丁香酚對照品200 μL，照2.2.1項下色譜條件測定，計算回收率。結果甲基丁香酚的平均回收率為103.90%,相對標準偏差為0.63%(n=6)，表明該方法準確度良好。

2.3 β-環(huán)糊精飽和水溶液法包合工藝研究

2.3.1 包合物的制備方法

采用飽和溶液法，取一定量β-環(huán)糊精與蒸餾水置錐形瓶內(nèi)，在設定溫度下用磁力攪拌器制成飽和水溶液。精密移取細辛揮發(fā)油500 μL，用體積分數(shù)為95%乙醇1 mL溶解，緩慢滴加至環(huán)糊精飽和水溶液中，保溫攪拌至規(guī)定時間。攪拌結束后，加適量乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽濾，棄去濾液，用少量乙醚洗滌，置烘箱中40 ℃干燥5 h，得揮發(fā)油環(huán)糊精包合物，稱定質(zhì)量。

2.3.2 單因素考察

2.3.2.1 乙醚對包合物收得率的影響

精密稱取3 g β-環(huán)糊精 2份，置錐形瓶內(nèi)，分別加入78 mL蒸餾水，45 ℃下用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。精密移取500 μL細辛揮發(fā)油2份，分別用1 mL 體積分數(shù)為95%乙醇溶解，緩慢滴加至環(huán)糊精水溶液中，保溫攪拌至規(guī)定時間。攪拌結束后，樣品1加適量乙醚4 ℃冷藏24 h，樣品2不加乙醚4 ℃冷藏24 h。取出后抽濾，棄去濾液，用少量乙醚洗滌，40 ℃減壓干燥5 h，得揮發(fā)油環(huán)糊精包合物，稱定質(zhì)量。稱量后測定收得率，樣品1為76.12%，樣品2為60.06%。結果顯示，包合物冷藏時加適量乙醚，有利于包合物的形成。

2.3.2.2 乙醇含量對包合物脫包合的影響

精密稱取0.5 g包合物3份，置錐形瓶內(nèi)，分別加入相同體積的體積分數(shù)分別為95%、80%、65%乙醇溶解，超聲60 min脫包合，抽濾，取續(xù)濾液稀釋10倍，測定HPLC，計算甲基丁香酚包合率。結果見表1。

表1 乙醇體積分數(shù)對包合率影響

由此可以看出，脫包合時的乙醇體積分數(shù)對甲基丁香酚包合率沒有太大影響，考慮到實際操作更加便捷，故選擇95%乙醇作為脫包溶劑。

2.3.2.3 脫包合方法的選擇

精密稱取0.5 g包合物6份，置錐形瓶內(nèi)，用25 mL 體積分數(shù)為95%乙醇溶解，分別采用超聲1 h后抽濾、超聲1 h后離心、超聲1 h后靜置、冷凝回流1 h后抽濾、冷凝回流1 h后離心、冷凝回流1 h后靜置的方法進行脫包合。經(jīng)HPLC測定，計算空白回收率，結果如表2所示。

表2 不同脫包合方法對空白回收率影響

由表2結果可知，超聲抽濾和回流離心的空白回收率較好，兩者差距不大，說明揮發(fā)油損失率低，為使試驗更加便捷，選擇超聲抽濾法進行脫包合。

2.3.3 甲基丁香酚包合率、收得率及載藥率測定

取制備好的包合物，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，照2.2.1項下色譜條件測定，按如下公式進行計算：

其中，y0為空白回收率；y1為甲基丁香酚包合率；y2為包合物收得率；y3為載藥率；x1為回收甲基丁香酚量；x2為投入甲基丁香酚量；x3為包合物中甲基丁香酚量；m1為包合物質(zhì)量；m2為β-環(huán)糊精投入量；m3為揮發(fā)油投入量。

2.3.4 評價指標

綜合評分加權處理時，包合率是評價包合效果的主要指標[12]，可以反映β-環(huán)糊精與揮發(fā)油量的關系，包合率愈高，包合效果愈好，影響揮發(fā)油穩(wěn)定性提高效果愈大，故權重系數(shù)定為0.5；收得率在實際生產(chǎn)中具有重要意義，在投入量確定的情況下，收得率愈高，包合率愈高，將收得率作為次要指標[13]，其權重系數(shù)定為0.3；載藥率也是控制包合質(zhì)量的重要因素，權重系數(shù)定為0.2。故按如下公式計算綜合評分(z)：

z=0.5y1+0.3y2+0.2y3。

通過多指標綜合評價，可較全面地反應包合物的制備工藝水平,為揮發(fā)油制劑工藝的優(yōu)化及新劑型的研發(fā)提供新的參考理論依據(jù)。

2.3.5 正交試驗設計

表3 因素水平表

表4 正交試驗結果

續(xù)表4

2.3.6 驗證試驗

取3份細辛揮發(fā)油，按照最佳工藝進行包合，包合物平均收得率為77.22%，相對標準偏差為2.512%(n=3)；甲基丁香酚平均包合率為74.64%，相對標準偏差為2.612%；平均載藥率為8.72%，相對標準偏差為2.95%。說明該條件下甲基丁香酚包合率、載藥率及包合物收得率比較穩(wěn)定，因此確定該工藝合理可行，結果見表6。

表6 重復性驗證試驗

3 討論

(1)β-環(huán)糊精包合方法有飽和水溶液法、研磨法和超聲法，經(jīng)查閱文獻及預試驗顯示，研磨法效果略優(yōu)于飽和水溶液法，但工藝費時費力，超聲法效果最差，考慮到實際生產(chǎn)中工業(yè)條件的限制，最終選擇飽和水溶液法進行包合。

(2)曾采用水蒸氣蒸餾法測定包合物中揮發(fā)油含量，但試驗發(fā)現(xiàn)空白回收率低，試驗準確性無法保證。故采用HPLC測定，通過綜合評分，能準確反映出揮發(fā)油藥效物質(zhì)的包合效果。

(3)溫度對β-環(huán)糊精在水中的溶解度影響很大，隨著溫度的升高，β-環(huán)糊精溶解度越大，采用飽和水溶液法制備包合物時, 要根據(jù)試驗溫度下β-環(huán)糊精的在水中的溶解度計算所得加水量 , 使得包合過程在β-環(huán)糊精的飽和水溶液中進行, 包合后低溫冷藏 , 以減少包合物的溶解 , 提高包合物的收率，可降低成本，減少服用量。大生產(chǎn)時應注意未包合揮發(fā)油的回收。

(4)該方法甲基丁香酚包合率為74.64%，損失了25.36%，損失部分包含該方法本身的試驗誤差4.94%(甲基丁香酚空白回收試驗結果為95.06%)，所以實際試驗中甲基丁香酚包合率要高于試驗值。

(5)驗證試驗表明，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，提高了揮發(fā)油中有效物質(zhì)甲基丁香酚的穩(wěn)定性并掩蓋了不良氣味，包合率較高，而毒性物質(zhì)黃樟醚在經(jīng)過大孔樹脂脫毒后，含量僅余3.84%，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，釋放緩慢，降低其刺激作用。該方法操作簡單，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，也為進一步的藥效評價和制劑工藝提供了質(zhì)量可控的包合工藝。