ERK1/2信號通路活化對Tamoxifen所致膠質瘤細胞凋亡的影響

田 芬,武慧姣,謝富康*,李朝紅*

(1.中南大學湘雅醫院生殖醫學中心,中國湖南長沙410008;2.中山大學中山醫學院組織學與胚胎學教研室,中國廣東廣州510080)

促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路是哺乳動物細胞內廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。該信號通路有3個主要的家族成員,分別為細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ER-K1/2)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38。MAPKs信號通路能夠參與調控多種癌細胞增殖、分化及凋亡等重要的生物學反應[1～2]。其中,ERK1/2信號通路能夠介導不同胞外刺激調控癌細胞凋亡[2～5],然而其具體作用機制仍有待進一步研究。

膠質瘤是中樞神經系統最常見的致死性腫瘤,約占所有顱內腫瘤的40%[6]。膠質瘤多呈彌漫性和侵潤性生長,與正常腦組織邊緣分不清,具有高發病率、高死亡率、高復發率和低治愈率等特點。雖然目前臨床仍以手術方法為主治療膠質瘤,但是由于腦功能的特殊性,化療在膠質瘤治療中起著越來越重要的作用。現已證實術后化療能延長患者的生存時間和提高患者的生存率[7～8]。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)即三苯氧胺,為非固醇類三苯乙烯衍生物,是強有力的雌激素受體(estrogen receptor,ER)拮抗劑,廣泛應用于ER陽性的乳腺癌、子宮內膜癌等的治療。近年來研究發現,TAM也能用于ER陰性的腫瘤化療,其中包括神經膠質瘤[9～10]。越來越多的研究表明TAM能抑制膠質瘤細胞增殖和誘導凋亡[11～12],然而其具體的分子作用機制尚不明確。

本研究以C6和U87MG膠質瘤細胞為研究對象,觀察MAPKs信號通路活化對TAM所致C6和U87MG膠質瘤細胞凋亡的作用,初步探討TAM誘導C6和U87MG膠質瘤細胞凋亡的信號轉導機制,為TAM作為膠質瘤的輔助性化療用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C6和U87MG膠質瘤細胞由中山大學附屬腫瘤醫院黃文林教授惠贈;TAM、MTT、DAPI、PD9-8059和瓊脂糖購自美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清、RPMI-1640培養基和胰酶購自美國Gibco公司;RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物和Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;BCA法蛋白質含量測定試劑盒和ECL化學發光液購自美國Millipore公司;DNA抽提試劑盒購置北京天根生化科技有限公司;兔抗p-ERK1/2、兔抗ERK1/2和兔抗β-actin購自Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MTT檢測

將復蘇后的C6和U87MG膠質瘤細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養至生長對數期,胰酶消化并制備細胞懸液;將200 μL C6和U87MG膠質瘤細胞懸液(含2×103個細胞)加入96孔板中,培養24 h后進行以下分組處理。實驗組：用細胞培養基稀釋4 000 μmol/L TAM母液至終濃度為 1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的TAM工作液;陰性對照組(NC組)：細胞培養基中加入等體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。將分組細胞放入37℃、5%CO2培養箱中分別培養12 h、24 h和48 h,隨后每孔加入20 μL MTT溶液,混勻后繼續培養4 h;吸去帶MTT溶液的培養基后加入150 μL DMSO,搖床輕微振蕩10 min,于酶標儀490 nm處測定其吸光度值(OD值)。根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3 DAPI染色檢測細胞核形態

取處于對數生長期的C6和U87MG膠質瘤細胞接種于6孔培養板(內含爬片)中,常規培養24 h后進行以下分組處理。實驗組：用細胞培養基稀釋4 000 μmol/L TAM母液至終濃度為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L 的 TAM 工作液;陰性對照組(NC組)：細胞培養基中加入等體積的DMSO。將分組細胞放入37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后取出爬片,PBS緩沖液洗兩遍;4%多聚甲醛固定10 min,吸去固定液,PBS緩沖液洗兩遍;加入DAPI染色液室溫避光孵育10 min,PBS緩沖液洗兩遍,隨后加甘油封閉并置于熒光顯微鏡下觀察C6和U87MG膠質瘤細胞核的形態。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

C6和U87MG膠質瘤細胞經1μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L TAM 溶液處理 24 h 或經PD98059預處理15 min再用30 μmol/L TAM溶液作用24 h后,收集細胞,用預冷的PBS緩沖液重懸細胞并計數。吸取1 mL細胞懸液(約1×105個細胞),離心去上清液,先加入195 μL Annexin VFITC結合液重懸細胞,隨后再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻;加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI),輕輕混勻,室溫避光孵育20 min后于流式細胞儀上檢測細胞凋亡。每個樣品重復3次。

1.5 Western-blot檢測ERK1/2的活化

C6和U87MG膠質瘤細胞經30 μmol/L TAM作用 5 min、15 min、30 min、60 min,或經 PD98059預處理15 min再用30 μmol/L TAM作用24 h,隨后收集細胞。用含有蛋白酶磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞,收集細胞總蛋白質,然后采用BCA法進行蛋白質定量。蛋白質樣本變性處理后,以每孔40 μg上樣,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳條帶轉移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶室溫封閉60 min,隨后加入相應一抗,4℃孵育過夜;次日,用TBST漂洗3次,每次10 min,然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h,漂洗后ECL化學發光法顯影,暗室曝光到X光膠片上。采用凝膠成像系統拍攝,并使用Gene Genius Bioimaging System對所存圖像進行定量分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0進行統計分析,實驗數據以均值±標準差(±s)表示,多樣本間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TAM能抑制膠質瘤細胞活性

不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞12 h、24 h和48 h后,采用MTT法檢測其細胞活性。結果顯示,隨著TAM濃度增加和作用時間延長,細胞活性逐漸被抑制,并呈濃度和時間依賴性。1～40 μmol/L TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞12 h、24 h和48 h后,C6膠質瘤細胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值分別是 39.78 μmol/L、29.48 μmol/L、16.05 μmol/L,U87MG膠質瘤細胞的IC50值分別是45.45 μmol/L、30.72 μmol/L、21.41 μmol/L(圖 1A)。另外,隨著30 μmol/L TAM處理時間的延長,細胞逐漸變圓、皺縮,細胞貼壁特性也逐漸喪失,并出現細胞漂浮現象(圖 1B)。

2.2 TAM能誘導膠質瘤細胞凋亡

我們通過DAPI染色法和Annexin V-FITC/PI染色法來確定TAM是否能夠誘導膠質瘤細胞發生凋亡。DAPI染色實驗結果顯示,對照組細胞核完整并被染成均一的淡藍色;不同濃度的TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞24 h后,細胞核呈現不同程度的凋亡形態特征,表現為核大小不一、固縮、碎裂、染色增強,且其凋亡呈濃度依賴性(圖 2)。

Annexin V-FITC/PI染色法實驗的結果也表明,與對照組相比,20～30 μmol/L TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞24 h后其凋亡率明顯增高并呈濃度依賴性,而10 μmol/L TAM組的凋亡率未見明顯增高(圖3)。以上結果提示TAM能夠明顯地誘導膠質瘤細胞凋亡。

2.3 TAM能增加ERK1/2磷酸化水平

我們采用 Western-blot檢測經 30 μmol/L TAM處理不同時間后C6和U87MG膠質瘤細胞中的ERK1/2磷酸化水平。實驗結果表明,TAM處理15 min時,ERK1/2磷酸化水平顯著增高(P＜0.05),但在接下來的15 min內,其磷酸化水平迅速下降,然后隨著TAM處理時間延長,其磷酸化水平又略有上升趨勢(圖4)。此結果表明TAM在短時間內能夠激活ERK1/2信號通路。

2.4 ERK1/2抑制劑能降低TAM所致ERK磷酸化水平增高

我們采用ERK1/2抑制劑(PD98059)預處理C6和U87MG膠質瘤細胞15 min,隨后加入30 μmol/L TAM處理24 h,然后采用Western-blot檢測ERK1/2磷酸化水平。實驗結果發現,與對照組相比,PD9-8059單獨處理組中的ERK1/2磷酸化水平明顯下調(P＜0.05),而TAM單獨處理組中的ERK1/2磷酸化水平明顯升高(P＜0.05);PD98059+TAM組與TAM單獨處理組相比,ERK1/2磷酸化水平顯著降低(P＜0.05,圖5)。以上結果提示,PD98059對TAM所致的ERK1/2磷酸化水平增高有明顯的抑制作用。

2.5 抑制ERK1/2信號通路能增加TAM誘導的細胞凋亡

為了探討ERK1/2信號通路在TAM所致C6和U87MG膠質瘤細胞凋亡中的作用,我們采用PD98059預處理細胞15 min,隨后加入30 μmol/L TAM處理24 h,然后用Annexin V-FITC/PI染色法檢測其細胞凋亡。實驗結果顯示,與對照組相比,PD98059單獨處理組的細胞凋亡率未見明顯變化,而TAM單獨處理組的細胞凋亡率明顯增高(P＜0.05);PD98059與TAM聯合處理比TAM單獨處理的細胞凋亡率更高(P＜0.05,圖6)。由此說明ERK1/2信號通路參與介導TAM誘導的膠質瘤細胞凋亡。

圖1 TAM對膠質瘤細胞活性的影響(A)C6和U87MG膠質瘤細胞經不同濃度TAM作用12 h、24 h和48 h后,細胞存活率的統計分析;(B)C6和U87MG膠質瘤細胞經30 μmol/L TAM作用12 h、24 h和48 h后,細胞形態學觀察結果。*表示與NC組相比,P＜0.05。Fig.1 Effect of TAM on glioma cell viability(±s,n=3)(A)Statistical analysis of survival rates of C6 and U87MG glioma cells treated with various concentrations of TAM for 12 h,24 h and 48 h;(B)The morphological observation of C6 and U87MG glioma cells treated with 30 μmol/L TAM for 12 h,24 h and 48 h.*Compared with NC group,P＜0.05.

圖2 不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞24 h后細胞核形態學的觀察結果Fig.2 The morphological observation of nuclei of C6 and U87MG glioma cells treated with various concentrations of TAM for 24 h

3 討論

越來越多的研究表明,多種信號通路參與調控TAM誘導的細胞凋亡和耐藥性[13～14]。本研究表明,TAM能夠誘導膠質瘤細胞凋亡和激活ERK1/2信號通路;ERK抑制劑能與TAM共同作用,促進TAM誘導的細胞凋亡。

圖3 不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質瘤細胞24 h對其凋亡水平的影響*與 NC 組相比,P＜0.05。Fig.3 Effects of various concentrations of TAM on the apoptosis of C6 and U87MG glioma cells after treatment for 24 h(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05.

圖5 TAM和PD98059聯合作用對ERK1/2磷酸化的影響*與 NC 組相比,P＜0.05;#與 TAM 組相比,P＜0.05。Fig.5 Effect of TAM and PD98059 on phosphorylation of ERK1/2 in C6 and U87MG glioma cells after treatment for 24 h(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05;#Compared with TAM group,P＜0.05.

圖6C6和U87MG膠質瘤細胞經TAM和PD98059聯合作用后的凋亡水平*與 NC 組相比,P＜0.05;#與 TAM 組相比,P＜0.05。Fig.6 The apoptosis of C6 and U87MG glioma cells co-treated with TAM and PD98059(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05;#Compared with TAM group,P＜0.05.

TAM作為抗腫瘤藥物,現已被應用于ER陽性的乳腺癌的治療,臨床上能顯著改善患者預后[15]。其主要作用機制是,通過與天然雌激素競爭性結合雌激素受體阻斷雌激素誘導的增殖信號,從而抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[16]。近年來研究發現,TAM也能通過ER非依賴的途徑誘導細胞凋亡。神經膠質瘤是一種非激素依賴性腫瘤,TAM對該腫瘤的作用一般是經ER非依賴的途徑來實現。相關的體內外研究表明,TAM能阻礙膠質瘤細胞生長,并且促進細胞凋亡[17]。我們的實驗結果也驗證了這一點,TAM能抑制膠質瘤細胞的活性(圖1),提高細胞的凋亡率(圖2、圖3),并伴隨著ERK1/2磷酸化水平增加(圖4）。

ERK1/2屬于MAPKs家族成員之一,根據相對分子質量的大小分為ERK1和ERK2兩種類型。在細胞靜息狀況下,ERK處于胞漿內,一旦受到一些生長因子、藥物等生物因素或放射線、高溫高壓等物理因素的激活,會迅速地穿過核膜進入核內,并激活下游轉錄因子,從而導致細胞產生相應的生物學效應。已有文獻報道,ERK1/2信號通路在骨肉瘤、食道癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性癌細胞中可被各種機制所激活,從而促進癌細胞增殖,抑制細胞凋亡[18～21],提示ERK1/2信號通路在細胞惡性轉化過程中起到至關重要的作用。同時,體外實驗研究表明,ERK1/2信號通路的活化能夠誘導膠質瘤細胞凋亡,并抑制細胞增殖[22]。我們的實驗結果表明,PD98059(ERK1/2抑制劑)能增加TAM誘導的膠質瘤細胞凋亡(圖5、圖6)。然而,這一結論與TAM誘導細胞凋亡和增加ERK磷酸化水平的結果(圖2～4)似乎相矛盾。我們分析可能是由于TAM能在短時間內快速激活ERK,反應性保護細胞,抑制其誘導細胞凋亡的作用;但是隨著TAM濃度的增加,細胞內其他促凋亡信號途徑將被激活,這些促凋亡信號途徑逐漸占據優勢,最終導致細胞凋亡。

綜上所述,本研究表明MAPKs家族中ERK1/2信號通路的激活參與了TAM對膠質瘤細胞的凋亡誘導作用,為TAM治療膠質瘤提供了重要的實驗依據。