臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒產量、鋅濃度及有效性的影響

張 慶，賈一磊，楊連新，王余龍，王云霞

（1.揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學環境科學與工程學院，江蘇 揚州 225009）

微量營養元素缺乏可導致人體異常發育和許多慢性疾病[1-2]。鋅、鐵都是人類容易缺乏的微量元素，全世界大約20億人被這兩個元素缺乏所困擾，造成每年有6300萬人因缺鋅/鐵死亡[3]。這些人群通常飲食單一，主要依靠C3谷物和豆類作物作為他們膳食中鋅和鐵的主要來源，而這些主食通常微量元素濃度和生物有效性較低[2，4]。因此，增加農作物食用部位微量元素的濃度已受到越來越多的關注[1-2，5-6]。隨著現代醫學的發展以及人類“回歸自然”的追求日趨強烈，通過生物強化策略即通過農藝或遺傳育種途徑提高主食微量元素含量，無需改變傳統飲食習慣，被認為是解決人類營養健康問題的主要途徑[1-2]。

一般認為根系是作物攝取鋅的主要途徑，葉面吸收則是重要的補充途徑。與土施鋅肥相比，葉面施鋅肥更加便捷，肥料利用率更高，還可避免土施可能造成的重金屬污染[2，7-10]，因此生產上有廣泛應用。小麥是世界上最重要的主食作物之一，但其食用部分鋅含量及其生物有效性均很低[2]。已有文獻表明，葉面施鋅不僅能高效便捷地增加麥粒的鋅濃度，還可增加其生物有效性[2，11-12]，但這些研究主要聚焦整個谷粒鋅的生物有效性，谷粒不同組分特別是面粉鋅的生物有效性報道較少[9-12]。

工業革命以來隨著人類活動的影響，臭氧的前體物如揮發性有機物和氮氧化合物大量釋放到空氣中，導致地表O3濃度上升；與其他國家相比，近年來我國地表O3濃度的增幅更為明顯，某些地區作物生長季的日平均O3濃度已經超過50 nL·L-1[13-14]。作為強氧化劑，目前空氣中的臭氧濃度升高已經對作物生產力造成危害，未來這種影響可能更為嚴重[13，15-18]。高臭氧濃度環境下，作物形態和生理上均會產生明顯變化，例如光合下調、葉片枯黃、植株早衰以及產量損失等[15-19]。多數情形下，臭氧濃度升高使禾谷類作物如小麥[20-22]和水稻[23-24]谷粒鋅濃度增加或不變，但谷粒不同組分對臭氧的響應是否一致尚待明確。植物食用部分鋅的生物有效性與植酸含量關系密切，后者在逆境下通常呈增加趨勢[25]。谷粒植酸含量增加通常降低鋅的生物有效性，但臭氧濃度升高環境下小麥籽粒不同組分植酸濃度的變化未見報道。另外，臭氧脅迫導致葉片氣孔部分關閉[17]，可能會影響葉面施鋅的效果，因為氣孔的存在和開張與葉片對極性溶液的吸收有關[26-28]，但這一假設尚未被驗證。

本研究以富鋅小麥青紫1號[29]為試驗材料，依托自然光氣體熏蒸平臺[30-32]，研究拔節至成熟期臭氧濃度升高和抽穗后葉面施鋅對小麥籽粒產量和鋅營養水平的影響。本文主要研究目的為：明確葉面施鋅、臭氧濃度升高對小麥產量的影響及其與產量構成因子的關系；葉面施鋅、臭氧處理對小麥籽粒不同組分鋅營養水平的影響強度；小麥鋅生物強化的效果是否受地表臭氧濃度升高的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2014—2015年在揚州大學文匯路校區自然光氣體熏蒸平臺上實施。試驗平臺的結構、性能和控制情況詳見文獻[30-32]。平臺為自然采光，同時利用土培方式培育植株，以避免盆栽方式對水稻根系生長的限制。土壤理化性質為：堿解N 70.0 mg·kg-1，速效 P 22.7 mg·kg-1，速效 K 62.5 mg·kg-1，有效Zn 9.7 mg·kg-1，土壤pH 7.5。

試驗采用裂區設計，臭氧處理為主區，葉面施鋅處理為裂區。臭氧處理設2個水平，即清潔空氣（Clean air，對照）和臭氧濃度升高（100 nL·L-1）。臭氧處理時間從2015年3月23日（拔節）至5月20日（成熟），這段時間因系統故障或天氣異常等原因停止運行4 d，實際運行55 d。臭氧處理從每日上午9：00開始至下午5：00結束。溫度、光照和大氣壓實時模擬室外環境[30]，平臺的控制動態示于圖1。臭氧是以純氧作為氣源，由佳環臭氧發生器（QD-001-3A）生產，通過臭氧分析儀（Model 49i）對處理濃度實時監測（圖1）。葉面施鋅處理設對照（噴施與葉面肥等量的清水）和噴施0.1%的硫酸鋅溶液（濃度以Zn2+計），噴施時期為開花期和花后1周，共2次，每次用量均為600 L·hm-2，每個處理重復4次。噴鋅時用塑料薄膜隔開其他植株，對葉片均勻地噴施上述溶液。

1.2 供試材料與培育

本研究以富鋅小麥品種青紫1號[29]為供試材料。2014年12月2日播種，采用人工條播方式，行距18.7 cm，100株·m-2。2014年12月15日間苗，2015年4月4日開花，2015年5月21日收獲。小麥全生育期施氮總量為22.5 g·m-2，其中基肥、拔節肥和孕穗肥分別占施氮總量的50%、30%和20%；基肥、拔節肥和孕穗肥分別于2014年12月1日、2015年3月16日和3月28日施用。磷和鉀施用量均為13.5 g·m-2，全部作為基肥施用。水分管理和病蟲草害防治同常規大田。

1.3 測定內容和方法

小麥成熟時每處理組合取8穴植株的穗子，手工脫粒后測定每穗粒數、千粒重，計算小麥理論產量。籽粒用磨粉機（Sedimat Laboratory Mill，BrabenderTMGmbH&Co，Germany）分為麩皮、次粉和面粉 3個組分，各組分的分離和收集參照齊義濤等[11-12]的方法，簡要說明如下：不能通過40目篩的部分為麩皮，通過40目但不能通過100目篩的為次粉，能通過100目篩的部分為面粉。

鋅的測定方法如下：稱取0.5 g烘干樣品置于微波消解罐中加濃硝酸5 mL和超純水3 mL，利用微波消解儀（MARS 5，CEM Corporation，USA）消解后定容至 50 mL，過濾后用 ICP-AES（IRIS Intrepid II XSP，Thermo Elemental，USA）測定濾液中鋅元素濃度。

植酸的測定主要參照Lapteva[33]，但對植酸提取步驟做了改進，簡述如下：在0.25 g左右烘干樣品中加入 5 mL 0.7%HCl，25 ℃恒溫振蕩1 h，4000 r·min-1離心15 min；取適量上清液，加入由FeCl3和磺基水楊酸配制的顯色劑進行顯色反應，然后在500 nm波長下測定樣品吸光度；根據由植酸鈉配制的標準曲線計算植酸濃度。

圖1 小麥生長季自然光氣體熏蒸平臺的控制狀態Figure 1 The performance of greenhouse-type fumigation chambers in wheat growing season

1.4 統計分析

數據用SPSS（V 19.0）進行統計分析，Duncun法進行多重比較；用Excel 2010繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒產量與產量構成的影響

青紫1號產量對臭氧濃度升高和灌漿初期葉面施鋅的響應示于圖2a。與干凈空氣相比，臭氧脅迫使小麥籽粒產量平均降低517 g·m-2，降幅為66%，其中不噴鋅和噴鋅條件下分別下降64%、68%，均達極顯著水平。與不噴鋅小麥相比，葉面施鋅對不同臭氧濃度環境下小麥的產量均無顯著影響。方差分析表明，臭氧脅迫與葉面施鋅對小麥產量無互作效應。

從產量構成因素看，臭氧濃度升高對小麥每平方米穗數沒有顯著影響，但使每穗粒數和千粒重較對照平均分別下降27%和53%，均達極顯著水平，不噴鋅和噴鋅條件下降幅相近（圖2b～圖2d）。與產量相同，葉面施鋅及其與臭氧處理的互作對3個產量構成因子均無顯著影響。

2.2 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒鋅濃度的影響

與清潔空氣相比，臭氧脅迫使籽粒鋅濃度平均增加27%（相當于13 mg·kg-1），其中不噴鋅和噴鋅條件下分別增加30%和25%，均達極顯著水平（圖3）。兩臭氧處理，葉面施鋅使籽粒鋅濃度平均增加24%，其中清潔空氣和臭氧脅迫下的增幅分別為27%、22%，均達極顯著性水平。統計分析表明，臭氧脅迫和葉面施鋅對籽粒的鋅濃度沒有互作效應。

圖2 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥產量（a）、每平方米穗數（b）、每穗粒數（c）和千粒重（d）的影響Figure 2 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on grain yield（a），panicle number per square meter（b），grain number per panicle（c）and 1000-grain weight（d）of wheat

圖3 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒鋅濃度的影響Figure 3 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on Zn concentration in grains of wheat

圖4 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒面粉、次粉和麩皮鋅濃度的影響Figure 4 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on Zn concentration in flour，shorts and bran of wheat

青紫1號小麥面粉、次粉和麩皮的鋅濃度示于圖4。所有處理平均，小麥面粉、次粉和麩皮的鋅濃度分別為21、31 mg·kg-1和98 mg·kg-1，次粉和麩皮鋅濃度分別是面粉的1.5倍和4.7倍，組分間差異達極顯著水平。臭氧濃度升高使小麥面粉、次粉和麩皮鋅濃度平均分別增加20%、41%和15%，其中未噴鋅條件下的增幅分別為18%、40%和18%，噴鋅下的增幅分別為21%、42%和12%，均達0.05以上顯著水平。與對照相比，葉面施鋅本身使小麥面粉、次粉和麩皮鋅濃度平均分別增加23%、22%和24%，其中清潔空氣下分別增加22%、21%和27%，臭氧脅迫下分別增加25%、23%和21%，均達0.05以上顯著水平。統計表明，臭氧×組分、鋅×組分之間的互作均達0.01顯著水平。

2.3 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒植酸濃度的影響

臭氧濃度升高使籽粒植酸濃度平均增加26%，不噴鋅和噴鋅條件下的增幅相近，均達極顯著水平（圖5）。葉面施鋅及其與臭氧處理的互作對該品種植酸濃度無顯著效應。

圖5 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒植酸濃度的影響Figure 5 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on concentration of phytic acid（PA）in grains of wheat

籽粒不同組分間植酸濃度存在極顯著差異：次粉、麩皮鋅濃度的植酸濃度平均分別是面粉的1.8倍和7.4倍（圖6）。與干凈空氣相比，臭氧脅迫使小麥面粉、次粉和麩皮植酸濃度平均分別增加8%、45%和13%，不噴鋅和噴鋅條件下增幅接近。與對照相比，葉面施鋅對上述組分的植酸濃度沒有顯著影響（除臭氧處理小麥的次粉部位，見圖6）。臭氧處理與組分互作對植酸濃度的影響達到了極顯著水平。

2.4 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒植酸與鋅摩爾比的影響

盡管臭氧濃度升高對籽粒植酸與鋅摩爾比沒有影響，但葉面施鋅處理使之平均下降18%，其中清潔空氣和臭氧脅迫下分別下降19%和16%，均達極顯著水平（圖7）。統計分析表明，臭氧和葉面施鋅處理之間沒有互作效應。

圖6 臭氧濃度升高與葉面施鋅對麥粒面粉、次粉和麩皮植酸濃度的影響Figure 6 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on PA concentration in flour，shorts and bran of wheat

圖7 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒植酸與鋅摩爾比的影響Figure 7 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on the molar ratio of phytic acid to Zn（PA/Zn）in grains of wheat

圖8 臭氧濃度升高和葉面施鋅對麥粒面粉、次粉和麩皮植酸與鋅摩爾比的影響Figure 8 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on PA/Zn in flour，shorts and bran of wheat

從不同組分的植酸與鋅摩爾比看，面粉、次粉和麩皮平均分別為15、18和24，組分間差異達極顯著水平（圖8）。與清潔空氣相比，臭氧濃度升高對小麥各組分植酸與鋅摩爾比多無顯著影響。與不施鋅相比，鋅處理使小麥面粉、次粉和麩皮植酸與鋅摩爾比平均分別降低17%、15%和19%，其中清潔空氣下分別下降15%、19%和21%，臭氧脅迫下分別下降18%、11%和17%，除臭氧處理小麥的次粉部位外均達顯著水平。統計表明，臭氧與鋅處理之間以及兩處理與組分之間的交互作用均未達顯著水平。

2.5 臭氧濃度升高和葉面施鋅對小麥籽粒不同組分鋅累積量和分配比例的影響

將小麥籽粒同一組分不同處理的鋅累積量進行平均，小麥次粉、麩皮的鋅累積量分別是面粉的2.7、7.9倍，組分間差異達極顯著水平（圖9a）。臭氧脅迫使麥粒各組分鋅累積量大幅下降，其中面粉的降幅（63%～67%）明顯大于次粉和麩皮部位（50%～61%）。與不施鋅相比，葉面施鋅使小麥面粉、次粉和麩皮鋅累積量均呈增加趨勢，清潔空氣下小麥的增幅大于臭氧脅迫下。臭氧×鋅、臭氧×組分對鋅累積量的影響均達顯著水平。

圖9 臭氧濃度升高和葉面施鋅對麥粒面粉、次粉和麩皮鋅累積量（a）和分配比例（b）的影響Figure 9 Effects of elevated ozone concentration and foliar zinc application on Zn accumulation（a）and distribution（b）in flour，shorts and bran of wheat

所有處理平均，面粉、次粉和麩皮中鋅累積量占比分別為8%、24%和68%，組分間差異達極顯著水平（圖9b）。臭氧脅迫對次粉和麩皮部位鋅的比例無顯著影響，但臭氧處理下不噴鋅小麥和噴鋅小麥面粉鋅的比例分別下降22%（P＜0.01）和17%（P＜0.1）。葉面施鋅處理對各組分鋅累積量占籽粒總鋅量的比例均無顯著影響。方差分析表明，僅臭氧×組分互作對麥粒鋅的分配有極顯著影響。

3 討論

小麥是對臭氧脅迫敏感的作物，臭氧脅迫環境下小麥產量明顯下降[13，17-19，22，34]。Feng等[34]對 52 篇文獻的整合分析發現，與干凈空氣相比，72 nL·L-1臭氧濃度使小麥產量平均下降29%。本研究表明，100 nL·L-1臭氧濃度使青紫1號籽粒產量由平均784 g·m-2降低到平均267 g·m-2，降幅為66%（圖2）。從產量構成因素看，臭氧濃度升高對小麥穗數沒有顯著影響，但千粒重和每穗粒數大幅下降，分別下降53%和27%。這與前人多數報道一致[18，34]。這一結果說明，臭氧脅迫對籽粒灌漿過程的抑制作用明顯大于穗分化過程，前者是產量損失的主要原因[18]。與臭氧處理不同，開花及花后1周葉面噴施0.1%ZnSO4對青紫1號產量及產量構成因素無顯著影響，這與多數小麥研究結果一致[6，35]。

前人研究表明，臭氧脅迫下籽粒微量元素包括鋅濃度多數表現為增加，但亦有沒有變化的報道[20-24]。本研究發現100 nL·L-1臭氧使籽粒鋅濃度增加27%，這一增幅大于前人報道[20-22]，這可能與青紫1號對臭氧濃度升高較為敏感有關，這也反映在臭氧脅迫下其產量大幅下降（圖2）。與人類營養直接相關的是面粉中的鋅濃度，本研究將小麥籽粒從外到內分為麩皮、次粉和面粉3個組分，與前人報道一致[11]，麥粒不同組分鋅濃度存在顯著差異，最外層麩皮的鋅濃度約為最內層面粉的5倍，不同處理谷粒趨勢一致（圖4）。籽粒外周麩皮富集鋅的能力大于次粉特別是面粉，這與麩皮包括糊粉層有關：該層具有高濃度的植酸和蛋白質，是一個富集鋅的強庫[10]。臭氧濃度升高對谷粒不同組分鋅濃度的影響未見報道。本研究發現無論是噴鋅還是對照，臭氧脅迫使麥粒各組分的鋅濃度均顯著增加，且臭氧與組分間存在互作效應：次粉鋅濃度的增幅明顯大于面粉和麩皮（圖4）。可能是由于臭氧脅迫使籽粒灌漿不完全，較小的籽粒中種皮占比相對較大，造成次粉中含有較多種皮成分。此外，一般認為，臭氧脅迫導致作物食用部分微量元素濃度增加的主要原因與“濃縮效應”有關，即臭氧脅迫對碳水化合物積累的影響大于微量元素[25]。臭氧脅迫下鋅濃度響應的這種部位差異是否由上述兩種可能機制造成，還是另有原因（如轉運），需要進一步研究。

前人研究顯示小麥抽穗后葉面施鋅能顯著增加谷粒中的鋅濃度[6，10-11，35-36]。本文富鋅小麥青紫 1 號籽粒的鋅濃度為42 mg·kg-1，籽粒鋅濃度高于普通小麥品種[29]。從鋅處理看，開花期及花后1周葉面噴施0.1%ZnSO4麥粒鋅濃度平均增加到60 mg·kg-1，增幅為24%；這個增幅與本文臭氧處理的效應接近，但略小于前人鋅處理的報道[6，10-11，35-36]。這說明噴鋅效果可能存在品種依賴[37]；另外，這也可能與本試驗噴鋅強度較小有關（表現在噴鋅濃度小且噴施次數少），例如齊義濤等[11]用0.2%ZnSO4噴施3次，而本試驗采用0.1%的ZnSO4噴施2次。從籽粒不同組分看，噴鋅處理使面粉、次粉和麩皮鋅濃度平均分別增加23%、22%和24%，各組分的響應很接近（圖4）。這可能與青紫1號對鋅的轉運效率較高有關，即籽粒發育早期葉面噴施鋅肥可高效增加胚乳部位的鋅濃度。本課題組前期研究亦發現類似現象[11]，但這種影響的生理機制還有待探明。

臭氧脅迫通常引發葉片受損和氣孔部分關閉，生長后期更為明顯[16-17]，這些均可能會削弱花后葉面施鋅的效果[26-28]。與此不同，本試驗結果顯示鋅處理使干凈空氣下籽粒面粉、次粉和麩皮鋅濃度增加21%～27%，使臭氧脅迫環境下各組分的鋅濃度增加21%～25%，兩種生長環境下的噴鋅效應沒有差異，這也表現在臭氧×鋅、臭氧×鋅×組分間均無互作效應（圖4）。一個可能的解釋是，臭氧脅迫環境下小麥生長受抑，群體變小，單位葉片面積噴到的ZnSO4溶液多于非脅迫小麥，這部分抵消了臭氧脅迫葉片氣孔部分關閉造成的不利影響。當然這一假設還需更多品種試驗的驗證。

鋅的營養水平除了與鋅濃度有關外，還與植酸的含量密切相關，后者容易與金屬離子結合形成難溶性的鹽，限制人類對包含Zn在內的營養元素的吸收[1，38]。與鋅在籽粒中的空間分布相同，植酸濃度亦以面粉含量最低，其次是次粉，麩皮最高（最大相差7.4倍），這與前人報道一致[12]。Wang等[25]綜述表明，逆境作物的植酸濃度通常呈增加趨勢，這會降低微量元素的生物有效性，但臭氧脅迫對麥粒植酸濃度的影響及其與籽粒不同部位的關系未見報道。本研究表明，臭氧處理使籽粒植酸濃度平均增加26%，其中面粉、次粉和麩皮植酸濃度平均分別增加8%、45%和13%，不噴鋅和噴鋅條件下增幅接近，多達極顯著水平（圖5～圖6）。臭氧處理對次粉植酸濃度的影響明顯大于其他兩個部位，這與前述的鋅處理影響相似（圖4），但其原因尚不清楚。從鋅處理影響看，前人報道結實期葉面施鋅使谷粒植酸濃度增加[2]或沒有影響[37]。本試驗中葉面施鋅及其與臭氧處理或組分間的交互作用對植酸濃度均無顯著影響（圖5～圖6），說明葉面施鋅不會造成植酸濃度的變化，不同臭氧處理或不同組分趨勢一致。

谷粒中鋅的有效性不僅與鋅和植酸的絕對量有關，更取決于植酸與鋅的摩爾比[1，39]。小麥籽粒不同組分的PA/Zn摩爾比從大到小依次為麩皮、次粉和面粉。臭氧濃度升高對小麥不同組分生物有效鋅的影響未見報道。本試驗中臭氧處理同時增加了麥粒不同組分鋅和植酸的濃度，故各組分的植酸與鋅摩爾比均沒有顯著變化（圖7～圖8）。前人少量研究表明，葉面施鋅使小麥籽粒 PA/Zn 摩爾比下降[9，12，36]。本文發現，葉面施鋅顯著降低小麥籽粒各組分的PA/Zn摩爾比：兩臭氧處理平均，鋅處理使小麥面粉、次粉和麩皮的PA/Zn摩爾比平均分別降低17%、15%和19%，各組分降幅相近，這與齊義濤等[12]報道一致。花后施鋅沒有改變籽粒的植酸濃度，因此PA/Zn摩爾比的降低主要是籽粒中鋅含量增加所致。另外，鋅處理對小麥籽粒PA/Zn摩爾比的影響亦不受臭氧熏蒸的影響，表現在臭氧×鋅、臭氧×鋅×組分互作均不顯著（圖8）。

從鋅分配看，鋅主要累積在麥粒麩皮和次粉部位，而這些部位在加工過程多被去除，導致面粉中的鋅含量銳減，只占籽粒總鋅的8%。因此，小麥的鋅生物強化應以增加面粉中的鋅濃度而非籽粒全鋅為重點[40-41]。雖然臭氧處理使籽粒鋅濃度增加，但產量銳減導致麥粒各組分鋅積累量均顯著下降，其中以面粉的降幅最大（圖9a）；與此相吻合，臭氧脅迫導致面粉的鋅分配比例顯著下降（-20%）。與臭氧處理有所不同，葉面施鋅使籽粒鋅濃度增加但產量未變，故籽粒鋅累積量亦隨之增加[11，42]；由于各組分增幅相近，葉面施鋅處理對三組分的鋅分配比例無顯著影響，與齊義濤等[11]報道一致。

4 結論

本研究表明，花后葉面施鋅能有效和高效地增加小麥品種青紫1號籽粒各組分的鋅濃度及其有效性，且葉面施鋅的效果不受臭氧濃度升高的影響。從小麥拔節開始，持續中等強度的臭氧脅迫使籽粒各組分鋅和植酸濃度同步增加，但由于產量大幅下降，造成小麥籽粒鋅累積量大幅下降。