myocardin通過激活miR-93-5p促進人主動脈血管平滑肌細胞分化

史丹陽，劉美玲，劉 翔，張 建，張同存，王 楠

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

動脈粥樣硬化等許多心血管系統疾病作為危害人類健康的危重疾病一直受到廣泛關注．成熟血管壁的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在血管損傷后由收縮表型向去分化表型的轉化在動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管疾病發生過程中有重要作用[1]．研究表明血清反應因子(serum response factor，SRF)與其順式作用元件 CarG[CC(A/T)6GG]-box的相互作用是啟動血管平滑肌細胞標志性基因表達的核心機制[2]．myocardin是 2001年發現的核蛋白(stress associated protein，SAP)結構域家族的一個成員，可在多種非肌細胞中與 SRF結合形成三聚體，并進一步顯著激活CArG box依賴的平滑肌和心肌特異表達基因的啟動子，包括α 平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle-actin，α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-myosin heavy chain，SM-MHC)、肌動蛋白α 2(actin alpha 2，ACTA2)基因等[3]．從而在分子水平上影響著血管平滑肌細胞的表型轉化．

微小 RNA(microRNAs，miRNA)是新近發現的非編碼RNA，具有調節基因表達的功能，在細胞的生長、分化和遷徙等過程中具有重要作用，是調控諸多病理生理現象的關鍵小分子[4]．Gareri等[5]研究表明，miRNA在血管平滑肌表型轉化中起到重要作用，miR-125a-5p通過靶向ETS-1(erythroblast transformation specific-1，ETS-1)調控血管平滑肌的表型轉化．但在 VSMCs表型轉化過程中myocardin與哪些miRNA相關目前尚未完全闡明．通過對 miRNA的啟動子分析發現 miR-93-5p的啟動子上有myocardin/SRF的結合位點 CArG box，因此推測myocardin可能是調控 miR-93-5p的關鍵轉錄因子．本研究旨在通過功能獲得或缺失實驗證實在人主動脈血管平滑肌細胞分化過程中 myocardin對miR-93-5p的轉錄激活作用．

1 材料與方法

1.1 細胞、菌種與質粒

人主動脈血管平滑肌細胞(human aortic vascular smooth muscle cells，HA-VSMCs)由本實驗室保藏，ATCC?編號為 CRL-1999．大腸桿菌(E.coli)DH5α、pGL3-Basic、pcDNA3.1-myocardin表達質粒、pRIGFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質粒、pRIGFP/Neo-Control(RNAi-control)質粒均為本實驗室保存．

1.2 主要試劑

myocardin一抗(rabbit)，天津賽爾生物技術有限公司；ACTA2一抗(rabbit)、SM22一抗(rabbit)，Abcam公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗，Santa Cruz公司；山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗，Li-cor公司；M-MLV 逆轉錄酶、Trizol 試劑，北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術有限公司；NheⅠ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA 連接酶，Promega公司；SYBR Green q PCR Mastermix，DBI Bioscience公司；dNTPs、D2000 DNA ladder、DM 2000plus DNA marker、通用型柱式基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Kit)，北京康為世紀生物科技有限公司；熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 轉染試劑，Roche公司．

1.3 細胞培養與轉染

HA-VSMCs用含有10%胎牛血清(無噬菌體，低內毒素)和 1% 100×青鏈霉素雙抗溶液的 DMEMHG培養基于 37℃、5% CO2培養箱培養．用 0.25%胰蛋白酶消化傳代，當細胞生長至 70%時，用脂質體介導法分別轉染空載對照質粒(pcDNA3.1)、myocardin過表達質粒(pcDNA3.1-myocardin)、pRIGFP/Neo-Control(RNAi-control)質粒和 pRI-GFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質粒．所用質粒濃度為 4μg/mL，操作按 X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 轉染試劑說明書進行．在轉染后 48h收集不同條件處理的 HA-VSMCs，分別收集細胞總蛋白或總RNA，進行后續實驗．

1.4 免疫印跡(Western blot)分析

收集各組細胞，SDS蛋白裂解液冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白含量．100℃變性 10min后，進行 12% SDS-PAGE電泳，通過電轉移將蛋白膠轉移至NC膜上．用5% 脫脂奶粉室溫封閉 1h后，分別用 ACTA2抗體(1∶500)、SM22α 抗體(1∶1000)、myocardin 抗體(1∶1000)在孵育袋中孵育，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗膜 3次，每次10min．隨后加入相對應的二抗(山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗)室溫避光孵育 2h，PBS洗膜 3次，每次 10min．Oddysey遠紅外成像系統掃膜，用Image J軟件對 Western blot結果進行定量分析．

1.5 總 RNA提取及實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)

先用 Trizol法提取總 RNA，參照 M-MLV逆轉錄方法進行逆轉錄．每組取 2μg總 RNA分別用miR-93-5p的反轉錄引物作為特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應，得到相應的逆轉錄產物cDNA．miR-93-5p 的反轉錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGACTGGATACGACCTACCTG-3′．取 2μL產物進行 Real-time PCR擴增，擴增體系為20μL：master mix 10μL，無菌蒸餾水 7.6μL，上、下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，50× ROX 0.4μL．PCR 條件：95℃預變性 2min；95℃變性10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s；40 個循環；95℃10s終止反應．檢測miR-93-5p的表達水平(U6為內參)，U6 上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物 為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-93-5p上游引物為5′-GAGTGTCAAAGTGCTGT TCGTG-3′，下游引物為 5′-GCAGGGTCCGAGGTAT TC-3′．

1.6 人基因組的提取

按通用型柱式基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Kit)提取基因組，先將人主動脈血管平滑肌細胞用胰酶消化處理為細胞懸液離心后棄上清液，加 200μL GTL，震蕩樣品至懸?。患尤?20μL Proteinase K、200μL Buffer GL，震蕩混勻，56℃水浴10min，離心后加入 200μL無水乙醇并混勻．按照基因組試劑盒說明書將上述步驟中所得溶液加入收集管的吸附柱中，離心棄廢液，向吸附柱中依次加入500μL Buffer GW1、500μL Buffer GW2，離心后棄廢液并將吸附柱徹底晾干．最后向吸附柱的中間部位懸空加入50～200μL Buffer GE或滅菌水，室溫放置2～5min，離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存.

1.7 miR-93-5p的啟動子質粒構建和熒光素酶報告實驗

在NCBI上查找miR-93-5p的啟動子序列，根據文獻查出與myocardin結合的CArG(CCTTAAAGG)結合位點．根據其序列以及pGL3載體確定酶切位點為 NheⅠ和 XhoⅠ，運用 Primer 5.0設計引物，上游引物為 5′-GTAGCTAGCCAGGTGAATTTCATGTTT AGACTGGAGT-3′(NheⅠ)，下游引物為 5′-ATTCTC GAGCCAAGACGGGAGGACAGAAAGGAA-3′(XhoⅠ)，片段為 1028bp．PCR 反應條件：94℃熱啟動5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃總延伸 10min，4℃保存．以人基因組為模板，按上述 PCR條件擴增后，純化PCR產物．用相應的限制性內切酶進行酶切，將酶切產物與用同樣限制性內切酶酶切的pGL3-Basic質粒用 T4 DNA 連接酶于 16℃孵育器連接 24h．轉化DH5α，在氨芐霉素抗性平板上挑選單克隆后，在氨芐霉素抗性液體 LB培養基中，37℃擴大培養 14h后，提取質粒進行雙酶切驗證并測序．

隨后在 24孔板中進行質粒轉染實驗．過表達myocardin實驗組為啟動子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pcDNA3.1-myocardin 表達質粒 0.5μg，對照組為啟動子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pcDNA3.1對照質粒 0.5μg；干擾 myocardin實驗組為 啟 動 子 (pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pRIGFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質粒 0.5μg，對照組為啟動子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pRI-GFP/Neo-Control(RNAi-control)對照質粒0.5μg；2μL脂質體．實驗步驟參考熒光素酶檢測試劑盒說明書進行，轉染 24h后加入 Luc裂解物冰上裂解細胞 30min，吸取 50μL裂解物，加入至預冷的白色 96孔板中；在酶標儀上設置程序．隨后采用考馬斯亮藍染色法進行蛋白質含量的測定．

1.8 統計學分析

所有數據均用“平均值±標準差”表示，采用SASV8軟件進行統計學處理分析，組間比較用單因素方差分析檢驗．

2 結果與分析

2.1 myocardin過表達促進HA-VSMCs分化

為證實 myocardin在平滑肌細胞分化過程中的重要作用，將對照質粒(pcDNA3.1)和 myocardin表達質粒(pcDNA3.1-myocardin)分別轉染入 HAVSMCs中 48h，利用 Western blot方法檢測myocardin的表達情況．已有研究證實 ACTA2和SM22α 是收縮型 VSMCs的最具特點的標志基因，通常以二者的表達活性作為判定 VSMCs分化表型的依據，因此檢測了分化標志性基因 ACTA2和SM22α 的蛋白水平，結果如圖1所示．

圖1 myocardin促進HA-VSMCs特異性基因的表達Fig. 1 Expression of HA-VSMC specific genes upregulated by myocardin

與對照組相比，轉染 pcDNA3.1-myocardin質粒組 myocardin蛋白水平顯著上調，同時分化標志基因ACTA2和 SM22α 的蛋白水平也顯著升高．這說明myocardin能顯著上調人主動脈平滑肌標志基因的表達，促進血管平滑肌細胞分化．

2.2 干擾myocardin抑制HA-VSMCs分化

為進一步證實 myocardin對平滑肌細胞分化的影響，將對照質粒(RNAi-control)和 myocardin干擾質粒(RNAi-myocardin)分別轉染入 HA-VSMCs中48h，利用 Western blot方法檢測 myocardin和分化標志性基因 ACTA2和 SM22α 的蛋白水平，結果如圖2所示．

圖2 myocardin抑制HA-VSMCs特異性基因的表達Fig. 2 Expression of HA-VSMC specific genes downregulated by myocardin

與對照組相比，轉染 RNAi-myocardin質粒組myocardin蛋白水平顯著下調，同時分化標志基因ACTA2和 SM22α 的蛋白水平也分別下調 40%和35%左右．這說明干擾 myocardin能顯著下調人主動脈平滑肌標志基因的表達，抑制血管平滑肌細胞分化.

2.3 myocardin與miR-93-5p的表達水平成正相關

對 miRNA的啟動子分析中發現，miR-93-5p啟動子上含有 myocardin的結合位點 CArG box，因此myocardin可能是上調 miR-93-5p的關鍵轉錄因子．為證實這一結論，在 HA-VSMCs中過表達myocardin．提取 RNA，逆轉后 Real-time PCR 檢測miR-93-5p的表達量，以U6為內參基因，結果如圖3所示，過表達myocardin后，miR-93-5p的表達顯著上調．這說明在平滑肌分化過程中 myocardin上調了miR-93-5p的水平．

圖3 過表達myocardin上調miR-93-5p水平Fig. 3 Myocardin upregulating the expression of miR-93-5p

2.4 干擾myocardin影響miR-93-5p的表達

進一步在HA-VSMCs中轉染myocardin的干擾質粒 pRI-GFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)降低內源性myocardin的表達水平后，檢測miR-93-5p的表達水平．提取 RNA，逆轉錄后進行 RT-PCR檢測miR-93-5p的表達量，以 U6為內參基因，miR-93-5p的水平也顯著下降(圖 4)．這些結果進一步說明miR-93-5p與 myocardin的表達成正相關，并且有可能介導myocardin對VSMCs特異性分化過程的調控.

圖4 干擾myocardin表達下調miR-93-5p水平Fig. 4 Myocardin downregulating the expression of miR-93-5p

2.5 miR-93-5p的啟動子質粒構建

為證實myocardin能否激活miR-93-5p的轉錄，構建 miR-93-5p啟動子熒光素酶報告基因質粒．在NCBI上查找 miR-93-5p的啟動子序列，設計引物，從人主動脈平滑肌細胞中獲得人的基因組序列作為模板，通過PCR法獲得所需要的啟動子序列1028bp(從-1037bp到0bp)，結果如圖5(a)所示．將pGL3-Basic載體和純化后的PCR片段分別用NheⅠ和XhoⅠ兩種限制性內切酶雙酶切，獲得目的片段和空載的線性片段．隨后將兩條線性片段進行連接轉化．當平皿上長出菌落后，挑取菌落，小提質粒后進行雙酶切鑒定，結果如圖 5(b)所示．pGL3-p-miR-93-5p-luc質粒經雙酶切后產生兩個片段，大小分別為4818bp和1028bp，4818bp片段與載體大小一致，1028bp片段與 PCR產物大小一致．這初步證明質粒構建正確，進一步通過測序鑒定，質粒構建成功．

圖5 構建miR-93-5p啟動子熒光素酶報告質粒Fig. 5 Luciferase reporting the construction of plasmid containing promoter miR-93-5p

2.6 myocardin增強miR-93-5p的啟動子活性

利用成功構建的 miR-93-5p啟動子熒光素酶報告基因質粒，進行熒光素酶報告分析．在HA-VSMCs中共同轉染 myocardin質粒和 miR-93-5p啟動子質粒，以 myocardin的空載質粒 pcDNA3.1和 miR-93-5p啟動子質粒的共轉為對照，進行熒光素酶活性檢測分析，結果如圖 6所示．myocardin能夠顯著增強miR-93-5p啟動子活性(圖 6(a))，而敲低 myocardin的表達后，miR-93-5p的活性也顯著降低(圖6(b))．這表明 myocardin能增強 miR-93-5p的啟動子活性，促進其轉錄．

圖6 myocardin增強miR-93-5p的啟動子活性Fig. 6 Myocardin enhancing the promoter activity of miR-93-5p

3 討 論

miRNA是近年來發現的能夠在轉錄后水平調節基因表達的一組非蛋白編碼小分子，廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內．成熟后能夠通過核酸序列互補識別特定的目標，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的．研究表明：其參與了細胞分裂增殖、分化與發育以及代謝等許多重要的生物學過程，因此有可能成為疾病診斷、預后判斷的指標及治療靶點．此外，在不同效應細胞亞群的分化中起重要作用．已有報道在 VSMCs中 miRNA在細胞多種功能中都起到了十分重要的作用[6]．目前已經有多篇文獻報道了 miR-125a-5p、miR-145[7]、miR-23b[8]、miR-18a-5p[9]等都能夠直接或者間接影響 VSMCs的表型轉化．Li等[10]證實myocardin可以通過上調miR-206促進平滑肌向分化表型轉化．但對于平滑肌分化過程中受到 myocardin調控的miRNA的了解仍然有限．

本研究發現 myocardin可以通過上調平滑肌分化標志基因 SM22α 和 ACTA2的表達，促進人主動脈平滑肌細胞向分化表型轉化，在此過程中 miR-93-5p的水平上調．而 myocardin的功能缺失實驗證實在人主動脈平滑肌細胞中敲低 myocardin的表達可以顯著降低miR-93-5p的水平．這些結果證實在平滑肌分化過程中myocardin與miR-93-5p的相關性．目前對于miR-93-5p的功能知之甚少，已有報道大多集中于腫瘤細胞中．miR-93-5p在腫瘤細胞中的作用也不盡相同，已經證實 miR-93-5p促進胃癌轉移[11]、子宮內膜癌上皮間質轉化過程[12]，但卻抑制乳腺癌細胞的上皮間質轉化過程[13]．目前尚未發現有關 miR-93-5p在血管平滑肌細胞中功能的相關報道，而本研究則證實了 miR-93-5p可能參與 myocardin調控的血管平滑肌細胞分化過程，myocardin可以激活miR-93-5p的啟動子活性，進而促進miR-93-5p的轉錄．

綜上所述，myocardin很可能通過上調 miR-93-5p參與對 VSMCs分化的調節．本研究所得結果為發現 myocardin功能的新機制提供初步實驗證據，并且發現 miR-93-5p可能參與血管平滑肌分化表型的調控作用．這對于心血管疾病病理機制的研究及新臨床治療靶標的研發提供參考．