血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體陽性雌鼠孕后出現妊娠期高血壓樣癥狀

邊經緯 尹曉辰 李 浩 張蘇麗 王美麗 劉慧榮

(首都醫科大學生理學與病理生理學系 代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室 代謝紊亂相關心血管疾病國際合作實驗室，北京 100069)

妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，該組疾病嚴重影響母嬰健康，是孕產婦和圍產兒病死率升高的主要原因。妊娠期高血壓疾病包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發子癇前期和慢性高血壓合并妊娠[1]。前3種疾病與后兩種有些不同，主要表現為患者妊娠前血壓正常，妊娠后出現血壓升高的臨床癥狀，前3種疾病的嚴重程度逐漸增加。但目前臨床上除使用對癥藥物減輕癥狀外，終止妊娠仍舊是唯一有效的治療手段[2]。因此疾病的預防和治療顯得尤為重要。

近年來的研究[3]顯示，一種存在于子癇前期患者血清中的病理性自身抗體，即血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)可能是導致子癇前期發展的重要因素。臨床調查[4]顯示，AT1-AA與子癇前期具有高度的相關性，且疾病的嚴重程度隨抗體效價的升高而逐漸升高。Zhou等[5]將AT1-AA注入妊娠小鼠體內后引發孕鼠出現血壓升高，尿蛋白含量增加等癥狀，提示AT1-AA是妊娠期高血壓疾病重要的發病原因。隨后越來越多的臨床研究顯示，AT1-AA不僅存在于子癇前期患者體內，還廣泛分布于妊娠期高血壓，以及其他疾病如原發性醛固酮增多癥，惡性高血壓，腎移植排斥，以及系統性硬化癥相關性肺動脈高壓等疾病[4]。值得注意的是，本課題組在部分健康人血清中也檢測到AT1-AA，但其潛在的病理意義不清。鑒于此，本研究目的在于探究AT1-AA陽性是否會增加妊娠后出現類似妊娠期高血壓癥狀的風險，以及引發癥狀的可能原因。

1 對象與方法

1.1 臨床樣本的收集

本實驗相關研究程序均經首都醫科大學倫理委員會批準，符合人體標本收集標準。受試者均已簽訂知情同意書。收集健康未妊娠女性、正常孕婦和子癇患者的血清用于AT1-AA檢測。子癇前期的診斷符合國際標準：正常婦女在妊娠20周后出現血壓升高(收縮壓>140 mmHg或舒張壓>90 mmHg， 1 mmHg=0.133 kPa)的臨床現象，并伴有以下一個或兩個以上癥狀：①蛋白尿；②孕婦器官功能障礙； ③子宮胎盤功能障礙。分娩時的孕周37～40周，平均孕周為(38.6±1.7)周；正常孕婦為妊娠期間體檢正常的孕婦，正常分娩，孕周37～40周，平均孕周為(39.3±1.2)周；健康非妊娠女性為健康體檢志愿者。3組在年齡、體質量、身高等方面盡可能一致。所有參與者均排除心血管疾病、腫瘤、自身免疫病、內分泌疾病等合并癥。依據以前研究[6]計算出最小樣本量為33 (OR=16.04，α=0.05，β=0.1)或18(OR=7.74，α=0.05，β=0.1)。本研究共收集48例健康未妊娠女性、56例正常孕婦和82例子癇前期患者。受試者基本情況詳見表1。

1.2 AT1-AA陽性大鼠模型構建

本實驗的所有研究程序均經首都醫科大學倫理委員會批準，符合“動物使用和護理指導原則”標準。合成純度為98%的人源AT1受體細胞外第二環抗原表位肽段(I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T)。通過數字表法將14只正常的SD雌性大鼠隨機分為溶劑對照組和主動免疫組。按照0.4 μg/g大鼠體質量的劑量和每只鼠注射0.5 mL總液體的標準計算出所用抗原溶液的體積，剩余液體用0.9%(質量分數)氯化鈉注射液補齊。首次免疫時，使用等體積的弗氏完全佐劑混合包含抗原的水溶液，背部皮下梅花點注射。后續加強免疫時，用等體積的弗氏不完全佐劑混合抗原溶液，背部皮下注射，2周1次。每次免疫前采血，并將所采血樣進行酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測。溶劑對照組以0.9%(質量分數)氯化鈉注射液代替抗原溶液，免疫方法同實驗組。免疫8周后AT1-AA穩定表達，屆時將溶劑對照組和主動免疫組的雌性大鼠分別與正常雄性SD大鼠交配，以見雌鼠陰道栓為妊娠0.5 d。整個過程中通過尾套法(BP-98A，Softron公司，日本)測量大鼠收縮壓。

1.3 酶聯免疫吸附實驗

將合成的AT1受體細胞外第二環抗原肽段(10 μg/mL)包被到96 孔板中，100 μL/孔，4 ℃過夜。第二天，使用含0.1%(體積分數)Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST，mmol/L： NaCl 137, KCl 2.7，Na2PO4·12H2O 10， KH2PO41.76；pH值為7.4)洗板3次。每孔加入400 μL由PBST配制的5%(質量分數)脫脂奶粉，37 ℃水浴中封閉1 h后，洗板3次。使用5%(質量分數)脫脂奶粉稀釋待測血清樣品(1∶10)，100 μL/孔，37 ℃水浴1 h，洗板。加入5%(質量分數)脫脂奶粉稀釋的辣根酶標記人或大鼠二抗(1∶500)，100 μL/孔，37 ℃水浴1 h，洗板。以1.1 mg ABTS加入1 mL雙蒸水的比例配制底物顯色液，用前混合3%(體積分數)H2O2(0.5 mL/L)，100 μL/孔，避光，37 ℃水浴30 min。用酶標儀在波長405 nm處讀取樣品A值。

在使用傳統ELISA方法檢測人血清中的AT1-AA時，有些樣品即使未包被抗原也會呈現陽性顯色，但在檢測大鼠血清時卻未發現此問題。因此，推測人血清中可能包含某些特殊物質與ELISA板結合。為排除此類因素造成的假陽性，實驗室針對人來源樣本的特殊性改進了ELISA方法，區別在于包被抗原的同時設置未包被抗原的空白孔(即只加抗原稀釋緩沖液)。P/N 值計算AT1-AA陽性率：P/N=(樣品A值-相應的未包被抗原孔A值)/(陰性對照A值-相應的未包被抗原孔A值)。樣品P/N≥2.1 為陽性。

1.4 腸系膜動脈血管環

妊娠第18天，大鼠麻醉后腹主動脈插管收集血液。剪取腸系膜組織浸泡在冰冷的HEPES緩沖液(mmol/L：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES 5，葡萄糖 11.0；pH值7.4)中。小心游離腸系膜三級分支血管，清除周圍的脂肪和結締組織，并將血管剪成2 mm長的環。血管環被固定在微血管環儀器(DMT 610 M, Danish Myo Technology, Denmark)中，浴槽提前備有HEPES緩沖液。實驗全程保持浴槽中的緩沖液通有95%(體積分數)O2+ 5%(體積分數)CO2的混合氣，溫度恒定在37 ℃。血管在平衡1 h后加入60 mmol/L K+-HEPES緩沖液(mmol/L：NaCl 29.8，KCl 120.1，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl22.5，葡萄糖 11.1，HEPES 5；pH值為7.4)。待血管收縮達到平臺期后，重新更換為HEPES緩沖液。通過Power Lab系統記錄血管張力。加入10-5mol/L的去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)。根據血管收縮百分比(NE和60 mmol/L K+-HEPES緩沖液誘導收縮的比值×100%)評價血管對收縮物質的反應性。使用NE預收縮血管，加入作用于內皮M受體的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，10-9～10-5mol/L)，根據血管舒張百分比評價血管內皮依賴性舒張功能；使用NE預收縮血管，加入直接引起一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放的NO底物硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP，10-9～10-5mol/L)，根據血管舒張百分比評價非內皮依賴性舒張功能。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 健康未妊娠女性、正常孕婦和子癇前期患者中均存在AT1-AA陽性人群

共收集了48例健康未妊娠女性、56例正常孕婦和82例子癇前期患者的血清(表1)。使用ELISA方法檢測血清中AT1-AA的濃度。子癇前期患者體內的AT1-AA含量顯著高于正常孕婦和健康未妊娠女性(圖1A)。69%的子癇前期患者體內AT1-AA呈陽性，其陽性率遠高于正常孕婦(29.0%)。8.3%的健康未妊娠女性中也存在AT1-AA (圖1B)。

2.2 AT1-AA陽性大鼠在妊娠12 d后血壓顯著升高

為模擬自身抗體在體產生的過程，通過主動免疫技術成功建立了AT1-AA陽性大鼠模型。結果顯示其間存在分組效應(F=746.40，P=0.000)和時間效應(F=114.03，P=0.000)，主動免疫大鼠血清中AT1-AA的A值自第2周(A值，0.3±0.0vs0.2±0.0，n=7，P<0.05，圖2A)起逐漸升高，并于第8周達到峰值(A值，0.9±0.1vs0.2±0.1，n=7，P<0.01，圖2A)，并且在結束免疫后的妊娠期第18天，AT1-AA陽性孕鼠血清中的AT1-AA仍維持很高水平(A值，0.86±0.04vs0.21±0.03，n=7，P<0.01，圖2B)，佐劑對照組并未檢測到AT1-AA。同時觀察到大鼠收縮期的血壓在免疫期間無明顯變化(圖2C)。大鼠妊娠階段血壓結果顯示存在分組效應(F=79.23，P=0.000)和時間效應(F=21.45，P=0.000)，與溶劑對照組相比，AT1-AA陽性孕鼠的血壓自孕12 d起開始顯著增加，于孕18 d達到峰值[(150±5)mmHgvs(118±7)mmHg，n=7，P<0.01，圖2D]。

Clinical profilesHealthy non-pregnant women(n=48)Normal pregnancy (n=56)Preeclampsia(n=82)Age/a28.4±3.028.2±3.230.2±2.1 Gestational weeks039.3±1.2 (38-41)38.6±1.7 (37-40)Han ethnic background (yes/no)48/056/082/0Systolic blood pressure/mmHg△101.1±9.2121.4±12.2166.2±10.0?Diastolic blood pressure/mmHg△70.3±7.371.6±8.196.2±8.0?Proteinuria/(mg·d-1)1.5±3.63.6±4.8 398.0±5.6??Family history of cardiovascular disease3 (6.3)3 (5.4)5 (6.1)Family history of hypertension3 (6.3)4 (7.1)7 (8.5)

△1 mmHg=0.133 kPa;*P<0.05,**P<0.01vsnormal pregnancy.

圖1 部分健康未妊娠女性中有AT1-AA分布Fig.1 AT1-AA in healthy non-pregnant women

A:P/N value;B: positive rate.*P<0.05,**P<0.01vshealthy non-pregnant women;##P<0.01vsnormal pregnancy;H:healthy non-pregnant women;N:normal pregnancy;PE:preeclampsia.

圖2 AT1-AA陽性大鼠懷孕后12天出現血壓升高Fig.2 Systolic BP of AT1-AA-positive rats elevated after gestation day 12

A:Active immune model of AT1-AA-positive rats was successfully established;B: High level of AT1-AA was detected on AT1-AA-positive rats on gestation day 18;C: There was no significant difference of systolic BP between vehicle and immunized group before pregnancy;D: Systolic BP of AT1-AA-positive rats were increased after gestation day 12;BP: blood pressure.n=7,*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group; △1 mmHg=0.133 kPa.

2.3 AT1-AA陽性孕鼠血管的收縮舒張功能異常

血壓升高與阻力血管病變密切相關，為探究AT1-AA陽性孕鼠血壓升高的具體原因，從血管的收縮和舒張兩方面評價了孕鼠血管功能。血管收縮功能的結果顯示，與對照組相比，AT1-AA陽性孕鼠對NE的血管收縮反應增強(NE/K+：130%±10%vs110±5%，n=7，P<0.05，圖3A～3C)。血管舒張功能的結果顯示其間存在組間效應(內皮依賴性：F=1536.20，P=0.000；非內皮依賴性：F=762.12，P=0.000)和濃度效應(內皮依賴性：F=885.32，P=0.000；非內皮依賴性：F=1138.71，P=0.000)且由ACh(圖3D、E)和SNP(圖3G、H)引起的血管舒張程度較溶劑對照組均顯著降低(ACh：60%±7%vs90%±4%，n=7，P<0.05，圖3F；SNP：75%±3%vs95%±1%，n=7，P<0.05，圖3I)。

圖3 AT1-AA陽性孕鼠阻力血管功能Fig.3 AT1-AA-positive rats exhibited resistance vascular dysfunction after pregnancy

A: Representative graph showed vasoconstriction of vehicle group after pregnancy upon NE stimulation;B: Representative graph showed vasoconstriction of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon NE stimulation;C: Column chart summarized the data of 7 independent experiments;D: Representative graph showed vasodilation of vehicle group after pregnancy upon ACh stimulation;E: Representative graph showed vasodilation of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon ACh stimulation;F: Statistics represented 7 independent experiments of vasodilation upon ACh stimulation;G: Representative graph showed vasodilation of vehicle group after pregnancy upon SNP stimulation;H: Representative graph showed vasodilation of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon SNP stimulation;I: Statistics represented 7 independent experiments of vasodilation upon SNP stimulation.*P<0.05vsvehicle group.NE: norepinephrine;ACh: acetylcholine;SNP: sodium nitroprusside. The arrows represented the addition of different stimulations.

3 討論

腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)在調節妊娠過程的血壓，血容量和離子平衡中起重要作用。正常女性在妊娠狀態下表現出RAS的激活，但其血管對于RAS中核心作用分子血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)引起的血管收縮反應卻有所降低。與之不同的是，雖然部分子癇前期患者血清中血管緊張素原，腎素活性以及Ang Ⅱ的表達降低，但其血管對于Ang Ⅱ刺激所引起的收縮反應卻顯著增強。提示子癇前期患者體內可能存在某種物質增強了Ang Ⅱ的敏感性[7]。Cunningham等[8]發現，AT1-AA可以增強腎動脈對Ang Ⅱ的敏感性。本研究通過微血管環實驗發現，AT1-AA陽性孕鼠的血管對其他縮血管物質，如NE的敏感性同樣升高。提示AT1-AA對Ang Ⅱ的增敏效果可能并非特異。

AT1-AA最早在1999年由Wallukat等[3]從子癇前期孕婦的血清中分離提純，可特異性地識別位于AT1受體胞外第二環，發揮類Ang Ⅱ的受體激動樣作用。且與Ang Ⅱ不同，AT1-AA可更持久的收縮離體血管，增加胞內鈣離子濃度，提示AT1-AA較Ang Ⅱ激活AT1R時間更長[9]。本課題組前期研究發現AT1-AA可致胸主動脈，腸系膜動脈，胎盤血管等全身動脈血管收縮[9-10]。在本研究中，AT1-AA陽性大鼠在主動免疫階段的血壓與溶劑對照組相比并無明顯升高。Wang等[11]將對AT1-AA主動免疫大鼠血壓的觀察延長至12個月，同樣未發現血壓的明顯變化。提示單純的血管持續收縮并非是AT1-AA導致血壓升高的主要原因。而在妊娠狀態下，孕婦血容量可比非妊娠時增加35%。此外，由AT1-AA刺激所致的sFlt1、sEng表達增加[12]， NO生物利用度降低，胎盤缺血、缺氧時激活的免疫和炎性反應[13-14]，以及本研究中AT1-AA陽性孕鼠阻力血管內皮依賴和非依賴的舒張功能受損均可能引起孕婦出現高血壓癥狀。

綜上所述，本研究發現AT1-AA陽性的雌性大鼠受孕后血壓較對照組顯著升高，主要原因之一是血管對收縮物質反應性增強，血管內皮依賴和非內皮依賴舒張功能損傷。本研究的創新性在于通過主動免疫技術構建AT1-AA陽性雌鼠，模擬臨床上AT1-AA陽性的女性。AT1-AA陽性雌鼠妊娠后出現血壓升高，血管損傷的現象，提示AT1-AA陽性的女性在妊娠后存在血壓異常升高的風險，應注意提前采取有效的預防措施。