東北褐環乳牛肝菌多糖提取及抗氧化活性研究

柴軍紅，何婷婷，于薇

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157012)

褐環乳牛肝菌主要分布于中國的東北、西南的松林或混交林地上，國外日本、歐洲及北美也有分布，是口感不錯的食用野生菌[1-2]。褐環乳牛肝菌富含多種氨基酸，維生素B族，粗纖維，多糖等[3-4]。其香氣成分中含松茸醇，異松茸醇，桂皮酸甲酯等組成其主要的風味成分[3]。此外，還含有多酚、黃酮及皂苷類化合物[5]。食用菌多糖具有安全性高、功能性強的特點，具備顯著免疫調節、抗病毒、抗氧化等活性是食用菌研究熱點之一[6]。近年來褐環乳牛肝菌主要圍繞生境、共生、培育及發酵生產等做了大量工作，諸如：員子晶等[7]、尹大川等[8-9]等研究松根際土壤關系及共生；李敏等[10]研究了發酵生產優化的等。此外也有一些分子方面研究，對于清除自由基研究，主要有劉剛，劉品華團隊做了一些比較研究[11-12]。

人體內自由基以氧自由基為主，多數自由基可以破壞核酸及染色體、干擾細胞代謝、結合破壞蛋白質和酶體系，從而加速機體的衰老[13]，可直接或間接引起慢性疾病及衰老效應[14]，所以補充抗氧化物質具有好的臨床及保健價值。褐環乳牛肝菌中含有多肽類、多糖類等，本文以黑龍江地區產的褐環乳牛肝菌為對象，希望為其開發提供一些理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

褐環乳牛肝菌：采自牡丹江地區，經過牡丹江師范學院曲秀春教授鑒定為褐環乳牛肝菌。

1.2 主要試劑

R-10纖維素酶，Y-23果膠酶(BR，美國Sigma公司)，DPPH(優級純，美國Sigma公司)，鄰苯三酚(AR,上海展云化工有限公司)，七水硫酸亞鐵(AR，天津博迪化工股份有限公司)，無水乙醇(AR，天津進豐化工有限公司)，食用酒精(95%，本地酒廠)，1,10-菲羅啉 (AR，瓦里西化工)，L-抗壞血酸(AR,上海埃彼化學試劑有限公司)，30%雙氧水、鹽酸(AR，哈爾濱試劑廠)等。

1.3 主要儀器

JJ-2型組織搗碎機勻漿機(武漢世紀超杰實驗儀器有限公司)；SL-2010N超聲波萃取裝置(南京順流設備有限公司)；T6紫外可見分光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；BSA224S-CW電子天平(德國賽多利斯集團)；LGJ-18S冷凍真空干燥機(鄭州鳴一儀器設備有限公司)；PB-10酸度計(德國賽多利斯集團)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 多糖提取。取1000g褐環乳牛肝菌用組織搗碎機破碎，以純水為提取劑，依據每100g固體加入1%果膠酶、2%纖維素酶，控溫37℃，pH在6.5下酶促處理2h；微波滅活；以固液比1∶10，功率600W，超聲波提取60min，提取2次[14]，合并濾液，濃縮至原體積1/10，sevage法除去蛋白，-70℃預凍8～12h，冷凍干燥備用。

1.4.2 多糖抗氧化研究。樣品液制備：精確稱取1.000g多糖的，配制成10mg/mL的提取物溶液作為母液。用母液分別配制2.0 mg/mL 、1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL的溶液[15]。

維生素C溶液現用現配。

1.4.2.1 超氧自由基清除能力測定：依據文獻方法[16-17]采用鄰苯三酚自氧化測定超氧自由基清除能力，總時間控制在3.5min內，并依據以下公式計算。

清除率(%)=[(C0-C1)/C0]×100

C0(自氧化)：自氧化時吸光度隨時間變化

C1(樣品，維生素C)：加入樣品液后吸光度隨時間變化

1.4.2.2 羥基自由基清除能力測定：依據文獻[15,17]，方法略有改變，在510nm，采用菲羅啉- FeSO4- H2O2體系研究羥基自由基清除能力，并依據以下公式計算。

清除率(%)=[1-(Q1-Q2)]/[Q3-Q2]×100

Q1：樣品(維生素C)+鄰二氮菲- FeSO4- H2O2體系溶液的吸光度；

Q2：H2O2溶液+空白樣品體系溶液的吸光度；

Q3：不加H2O2和樣品(維生素C)的體系溶液的吸光度。

1.4.2.3 DPPH自由基清除能力測定：依據文獻方法[18-19]，略有改動，在520 nm下，暗條件反應30min，并依據以下公式計算。

清除率(%)=[1-(D1-D2)/D0]×100

D0：DPPH和95%乙醇的吸光度

D1：DPPH和待測樣品(維生素C)的吸光度

D2：待測樣品(維生素C)95%乙醇的吸光度

2 結果與討論

2.1 多糖超氧自由基的清除作用

圖1 多糖對超氧自由基的清除作用

依據圖1結果，濃度在0.2～0.6mg/mL清除率變化較平穩,并且隨著濃度升高變大，顯示濃度-清除率具有相關性，0.8mg/mL清除率可達48%以上，顯示一定的清除能力。

2.2 多糖對羥基自由基的清除作用

圖2 多糖對羥基自由基的清除作用

依據圖2結果，當濃度0.2～0.6mg/mL清除率變化較為平緩，0.8mg/mL以上出現較大變化，最終達到62%以上，顯示較好清除率效果，由于羥基自由基與人體衰老有一定聯系，所以多糖具有一定潛在抗衰老活性[20]。

2.3 多糖對超氧自由基的清除作用

圖3 色素對DPPH自由基的清除作用

在整個實驗濃度區間清除率上升較為平緩，這與文獻[11-12]較為吻合，在濃度在1mg/mL時就達到28%以上，體現出一定抗氧化效果。

2.4 多糖紅外測定結果

圖4多糖紅外光譜

依據圖4其3349.42cm-1附近的強吸收峰為O-H或N-H伸縮振動峰；在2924.04cm-1處的尖峰是C-H(-CH2)伸縮振動峰；其1079.56cm-1、1026 cm-1、548.42cm-1為吡喃糖特征吸收之一[15,21]，在1652.97cm-1處的強尖峰是C=O(-CHO)的伸縮振動峰，表明此多糖為吡喃糖；578.42cm-1的弱小尖峰是β-吡喃環彎曲振動峰，通過以上結果說明多糖為β-型吡喃多糖。

3 結論

在樣品測定濃度范圍內，隨著濃度的提升多糖對超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基的清除能力也逐漸增加。結果表明：其多糖對羥基自由基(·OH)的清除率為62.19%，顯示出具有抗疲勞應用前景；多糖對超氧離子自由基(·O2-)的清除率最高為48.30%；其紅外表征顯示多糖為β-型吡喃多糖，所以多糖具有一定開發潛力及價值。