探討DHEA對閉鎖卵泡形成的機制

張海甄，翁嘉敏，史惠媚，吳佳琳，朱文俊，高梓博，楊舒含，梁卓潼，陳家旭*

（暨南大學中醫學院，廣東 廣州 510000）

目的:本研究重點著重于對比小鼠的體重、卵巢形態、卵巢體積和相對質量、卵巢組織學變化、發情周期變化、小鼠性激素水平和卵巢組織學變化作為指標，并采用C56 BL/6小鼠結合DHEA皮下注射法建立小鼠閉鎖卵泡模型。根據受體蛋白的表達水平評價，以選擇合適的小鼠模型研究閉鎖卵泡。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從廣州中醫藥大學實驗動物中心（許可證號：SYXK(粵)2013-0034)購入的32只28天齡雌性C57BL/6小鼠，適應性飼養4天，至32天齡開始注射。其中，將以10只為一組隨機分成實驗組，實驗對照組和空白對照組。

1.2 DHEA建模法

實驗組小鼠頸部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)6 mg/100 g+0.2 ml注射油，注射14天后處死并觀察結果。結果顯示實驗組在病理組織檢查下存在閉鎖卵泡。

1.3 小鼠血清性激素水平

使用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒中測量血清性激素水平。建模塊小鼠的典型激素變化是LH、FSH降低、LH/FSH升高。從而可見脫氫表雄酮能誘導高雄激素(AR)狀態，符合鹿特丹高雄激素的診斷標準。實驗組小鼠P水平下降，提示無排卵，人閉鎖卵泡一致。在閉鎖卵泡中，LH升高是P介導的LH負反饋，DHEA實驗組血清T升高，主要用于腎上腺雄激素源性雄激素所致的閉鎖卵泡。DHEA實驗組的血液FSH水平適合于阻斷毛囊中高水平的雌激素。見表1。

表1 各組小鼠血清中性激素水平對照

1.4 標本的采集和處理

在第14天，稱重所有小鼠，然后用眼球取血。將血清儲存在-80℃，從背面掏出雙側卵巢，用卡尺丈量長度（A），寬度（B）和厚度（C）。卵巢的一側固定在4%多聚甲醛溶液中，另一側固定在卵巢。 用PBS沖洗并儲存在-80℃儲存。

1.5 卵巢組織學檢查

石蠟包埋小鼠卵巢最大平面作為待檢平面，每個蠟塊切兩次，厚度為4 μm一塊，以HE染色。

1.6 卵巢中受體蛋白檢測

采用免疫組織化學SP法檢測雄激素受體（AR）和黃體生成素受體（LHR）在小鼠卵巢中的表達。Western blot檢測各組卵巢AR和LHR的相對表達。

2 結 果

（1）小鼠一般情況：正常組反應以至身體機能正常；反之建模塊的小鼠反應遲鈍，體毛正常，拉便稀。

（2）小鼠體重和發情周期的變化：DHEA實驗組小鼠體重增加（P＞0.05），實驗組小鼠發情周期變化非常不規律，執行當天發情周期沒有完全消失。

（3）卵巢的形態、組織學和相對質量等變化：在DHEA實驗組中，卵巢表面輪廓蒼白，卵泡泡囊突起不明顯。從組織學切片中可見實驗組小鼠卵巢上有閉鎖卵泡形成。

（4）小鼠性激素水平的變化：DHEA實驗組血清中T濃度和FSH濃度顯著高于對照組（P＜0.05）。

（5）受體蛋白在小鼠卵巢中的表達:DHEA實驗組小鼠卵巢AR的表達(P＜0.05)。

3 討 論

多囊卵巢綜合征（PCOS）是現今婦女常見的內分泌疾病，具有高度異質性。其涉及關系到遺傳學，內分泌，糖脂代謝，蛋白質代謝和局部卵巢調節因子等異常所致。多囊卵巢綜合征患者病人多見肥胖，表現為脂質代謝紊亂。病理生理學和臨床表示多樣化，因此病因尚不明確。但其中特征可有組織學顯示多囊性卵巢改變，慢性無排卵的臨床表現; 內分泌學的特征在于雄激素過多癥和血清LH升高，頭發，痤瘡和不育的臨床表現。血清學上顯示其與高胰島素血癥和胰島素抵抗有關。其中亦可刺激雄激素(AR)分泌，提高雄激素利用率，可間接影響PCOS女性患者的生殖功能。臨床表現為胚胎植入和妊娠受損。PCOS的短期問題是直接影響婦女生育，形成生殖障礙；長久后不單會使婦女生殖出現障礙，更大的問題是能使患者代謝紊亂。PCOS與糖尿病，高血壓和子宮內膜癌等長期并發癥有明顯的關聯，且損害亦為嚴重。由于目前病因不明，因此現今尚無明確有效的治療方法，這在婦科內分泌領域一直是一個難點和熱點問題。他們大多數都是根據藥物治療，幾乎沒有手術，臨床困難，并建立適當的動物。研究PCOS機制和診斷策略的模型是非常必要的。

由于PCOS的發病機制及機理尚不清楚，因此很難創設一種能夠模擬PCOS所有病理特征的動物模型。PCOS的一些動物模型只能從一個或多個方面模擬PCOS的病理特征，甚至一些模型似乎與PCOS的模型相反。因此，這些動物模型并未很好地應用在臨床方面。 選擇合適的動物模型對于PCOS的研究非常重要。

3.1 PCOS模型中DHEA造模的理論依據

這種方法的原理是部分鎖定PCOS患者在青春期出現閉鎖卵泡的癥狀，即血清DHEA水平升高所致。推測DHEA升高可能是閉鎖卵泡的一個重要原因。DHEA是孕烯醇酮經Δ5途徑轉化雄烯二酮的中間的產出物。其中能通過外源途徑提高DHEA程度，從而可以提高雄烯二酮水平，最后使高酮水平出現等血液病理學特征。

3.2 小鼠卵巢中受體蛋白的AR和LHR表達量與閉鎖卵泡之間的關系

閉鎖卵泡典型的內分泌特征是高雄激素(AR)血癥和高血清促黃體生成素(LH)水平，其分別與卵巢中的受體蛋白AR和LHR結合。

活性濾泡小鼠的促性腺激素受體活躍是其中一個關鍵。LaPolt等提出該標記的表達顯著降低其增殖和分化的能力，表現為顆粒細胞層的減少。

LHR主要分布在小鼠卵巢中顆粒細胞的細胞質和內細胞以及外細胞的細胞質中。動態濾泡能使小鼠血清中LH水平上升從而增加濾泡細胞中的LHR的表達，導致顆粒細胞分化和卵泡發育阻滯，可作為連續性無排卵的指標。

總括而言，從本次實驗中可得出的結果提示AR和LHR均參與了小鼠卵巢多囊卵巢以及閉鎖卵泡的形成，由此可作為閉鎖卵泡模型中蛋白質水平評價的指標。