活化的Treg細胞對NKT細胞遷移的調節作用

盧燕鳴 李亞琴 周文靜 李小燕 于 清

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種兒童常見的慢性氣道炎癥性疾病，近年來因環境污染等因素的影響，其發病率逐年增高，給患兒及家長帶來沉重的經濟和社會負擔。其病理機制的本質是炎癥引起的氣道高反應性和氣道重塑[1-2]。且目前普遍認為，Th1/Th2失衡是哮喘發病的關鍵因素[3-5]。其中CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cell, Treg)和自然殺傷T細胞(natural killer T cell, NKT)是兩種重要的免疫調節細胞。Treg細胞以Foxp3為特征性的標記，具有免疫抑制功能。大量的臨床及基礎研究顯示Treg細胞功能異常導致Th1/Th2失衡是支氣管哮喘發病的中心環節[6-7]。NKT細胞可同時表達NK細胞標志和T細胞標志，被CD1d呈遞的糖脂類抗原激活后迅速分泌大量IL-4和IFN-γ。本實驗早期對52例兒童NKT進行分析，結果顯示支氣管哮喘的外周血NKT水平大幅下降；屋塵螨致敏哮喘小鼠模型中發現哮喘發病過程中脾臟NKT水平也下降；提示哮喘發病過程中有顯著的NKT細胞遷移，過敏性哮喘與NKT 細胞失調相關[8-9]。

有臨床研究顯示，過敏性哮喘中NKT可以殺滅Treg細胞，這可能是哮喘患者Treg細胞水平低下的原因之一[10]。Thorburn等[11]發現誘導Treg細胞可以抑制iNKT，進而控制哮喘。我們在動物哮喘實驗中首次發現，通過Foxp3基因轉移可以活化Treg細胞，從而抑制iNKT的活化而減輕嗜酸性細胞的浸潤和氣道高反應(AHR)[12]。目前有限的數據顯示，Treg細胞和NKT細胞在哮喘發病中相互影響，但是二者之間的相互調節方式和調節機制尚不清楚。回答這一科學問題，不僅可以幫助我們更準確地把握哮喘的免疫學發病機制，而且有可能可以指導我們更精確有效地治療這種疾病。

結合以上實驗背景及本實驗室早期的研究，本文擬通過體外共培養Treg細胞和NKT細胞，并建立OVA致哮喘小鼠模型在體內探索Treg細胞對NKT細胞的調控作用，尤其是調節NKT細胞遷移/體內分布的可能性。

材料和方法

一、材料與試劑

1. 主要試劑: 卵清蛋白(OVA，Ⅴ級)購自美國Sigma公司；IL-4、IFN-γ 、IL-10及TGF-β ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司；熒光標記抗體(CD4、CD25、CD3、CD161)購自美國BD Bioscience 公司；Foxp3和α-tubulin抗體購自美國Cell Signaling公司；RNeasy試劑盒及引物均購自德國Qiagen公司；其余試劑均為國產市售。

2. 實驗動物： 實驗所用動物為10周齡雄性健康清潔級BALB/c小鼠，由上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物中心。所有動物實驗操作均經仁濟醫院實驗動物管理及倫理委員會批準。

二、實驗方法

1. Treg細胞、NKT細胞分選及純化： 參照我們已建立的方法[12]，70目尼龍網分離小鼠脾細胞，采用免疫磁珠吸附陰性選擇方法，分離CD4+CD25+CD127low細胞作為Treg細胞，分離CD4+CD25-的T細胞為效應T細胞(Teff細胞)。制備α-GalCer-CD1d-PE四聚體，而后用anti-PE和anti-TCRβ經流式細胞儀分選表達CD1d和TCRβ的NKT細胞，所得NKT細胞用α-GalCer擴增分離。

2. Foxp3修飾Treg細胞： 表達小鼠Foxp3的慢病毒由本實驗室早期構建成功[12]，用純化的重組慢病毒感染Treg細胞，Polybrene的濃度為6 μg/ml，細胞隨機分組：空白對照組(Ctrl)；空載體轉染組(Le-scr)；Foxp3轉染組(Le-Foxp3，MOI=0.5, 1, 2, 5, 10)。測定轉染效率后用于后續實驗分析。

3. CFSE標記法測定Treg細胞對Teff細胞增殖的抑制作用： Treg細胞和Teff細胞經培養液重懸并調整細胞濃度為1×106個/ml。而后將Treg細胞(Le-scr或Le-Foxp3)和Teff細胞各100 μl加入包被抗CD3抗體(5 μg/ml)的48孔培養板中，并向每孔加入抗CD28抗體(2 μg/ml)，置于培養箱中繼續培養60 h。用流式細胞儀檢測各組CFSE標記的Teff細胞增殖率(PR)并評估Treg細胞對Teff細胞增殖的抑制作用。

4. INF-γ，IL-4及TGF-β，IL-10 的檢測： 各組細胞經相應處理后，IL-4、IFN-γ、IL-10及TGF-β的檢測依據美國eBioscience公司提供的ELISA試劑盒檢測說明書進行。

5. Treg-NKT體外共培養實驗： Treg細胞和NKT細胞經培養液重懸并調整細胞濃度為1×106個/ml。24孔Transwell板下室中接種Treg細胞(Le-scr或Le-Foxp3)，5 μm孔徑的transwell insert中接種NKT細胞。將培養板置于37 ℃，含5% CO2的恒溫培養箱中混合培養72 h，共培養結束后將下室的細胞轉移至流式管，抗體標記(anti-CD3和anti-CD161)后經流式細胞儀檢測NKT細胞的數量。而后收獲上清液，檢測細胞因子的水平。

6. RT-PCR檢測Foxp3 mRNA的表達： RNeasy試劑盒抽提細胞內RNA，經逆轉錄酶逆轉錄為cDNA，然后采用QuantiTect SYBR Green PCR的方法檢測Foxp3 mRNA的表達。引物購自德國Qiagen公司；以α-tubulin為內參，采用2-ΔΔCT法分析基因的相對表達量。

7. Western Blot實驗： 用RIPA于冰上裂解收集細胞蛋白， BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調整各孔上樣蛋白量并按1︰3的比例加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5min變性后用SDS-PAGE進行凝膠電泳。之后將蛋白電轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫條件下封閉90 min。依據說明書要求先后孵育入一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗，撒化學發光液于暗室中顯影，定影后沖洗膠片。結果采用Image J行灰度半定量分析。

8. OVA致小鼠哮喘模型

參照本實驗室已建立的方法制備OVA致小鼠哮喘模型[12]。取32只野生型BALB/c小鼠，按照隨機數字表法將小鼠隨機分為對照組(sham組，只接受PBS處理)、OVA模型組(OVA組)、OVA+Le-scr組(OVA模型小鼠在實驗第15天經尾靜脈注射2×106Treg/空載體細胞)和OVA+Le-scr組(OVA模型小鼠在實驗第15天經尾靜脈注射2×106慢病毒修飾的Treg/Foxp3細胞)。在實驗的第24天收獲小鼠的外周血(麻醉后摘除眼球取血)、脾組織及肺組織，經流式細胞儀分析NKT細胞的分布情況。

三、統計學方法

結 果

一、慢病毒載體轉染效率檢測

RT-PCR及Western blot 檢測結果顯示(圖1A和B)，轉染攜帶Foxp3的慢病毒載體可促進Treg細胞中Foxp3的表達， MOI=2時，Foxp3的表達增加顯著(P<0.01)，結果說明Le-Foxp3可用于后續實驗。

圖1Le-Foxp3轉染效率檢測；注：A：RT-PCR檢測Treg細胞中Foxp3的表達；B：Western blot檢測Treg細胞中Foxp3的蛋白表達

二、表達Foxp3對Treg細胞功能的影響

Treg細胞主要通過調控效應T細胞(Teff細胞)的功能來實現其維持機體免疫穩態的作用，本實驗通過共培養表達Foxp3的Treg細胞和Teff細胞來檢測表達Foxp3對Treg細胞功能的影響。結果如圖2A所示，相較于Le-scr組；Le-Foxp3組Teff細胞的增殖指數降低， Treg細胞對Teff細胞的抑制率顯著增加。同時活化的Treg細胞可分泌細胞因子IL-10和TGF- β抑制免疫反應。本實驗中ELISA的結果顯示(圖2B)，相較于Le-scr組；Le-Foxp3組IL-10和TGF-β的水平顯著上升。結果說明表達Foxp3可活化Treg細胞。

三、表達Foxp3的Treg細胞對NKT細胞體外遷移和活性的影響

體外共培養Treg細胞和NKT細胞，以探討Treg細胞對NKT細胞遷移及活化的調控作用。共培養結束后采用流式細胞儀檢測下室中NKT細胞的數量。結果顯示，轉染Foxp3后，遷移到下室的NKT細胞由Le-scr組的649.38±153.97減少至221.15±79.36(P<0.05)。RT-PCR和ELISA檢測培養上清中IL-4和IFN-γ的水平，結果顯示(圖3)：相較于Le-scr組，Le-Foxp3組共培養體系上清液中IL-4和IFN-γ的水平顯著降低，差異具有統計學意義。

圖2表達Foxp3對Treg細胞功能的影響；注：A：CFSE標記法檢測Treg細胞對Teff細胞的增殖抑制作用；B：ELISA檢測細胞因子IL-10和TGF- β的水平

圖3RT-PCR(A)和ELISA(B)檢測表達Foxp3的Treg細胞對NKT細胞胞內因子IL-4和IFN-γ分泌的影響

四、OVA致哮喘小鼠模型中Treg細胞對NKT細胞體內分布的影響

本實驗進一步引入OVA致哮喘小鼠模型，檢測哮喘發病過程中表達Foxp3后Treg細胞對NKT細胞體內分布的影響。結果顯示(圖4)，相較于OVA組， OVA+Le-Foxp3組小鼠肺組織中NKT的數量顯著降低，而外周血及脾臟中NKT的數量顯著升高。因實驗過程中發現，OVA組和OVA+Le-scr組結果不具有顯著差異，故結果中未顯示OVA+Le-scr組數據。

圖4OVA哮喘模型中Treg細胞對NKT細胞體內分布的影響

討 論

本文首先檢測了體外構建的Foxp3病毒載體的轉染效率，結果顯示Treg細胞中轉入Foxp3病毒載體后Foxp3的表達顯著升高，證明所構建的載體可用于后續實驗。Foxp3是Treg細胞的特征標志，也是其最重要的功能分子，大量研究表明高表達的Foxp3與Treg細胞免疫抑制功能之間有良好的相關性[13-14]。本文進一步檢測了直接通過病毒載體表達Foxp3對Treg細胞功能的影響。結果發現表達Foxp3可提高Treg細胞對Teff細胞的增殖抑制率，同時促進Treg細胞分泌細胞因子IL-10和TGF- β。結果提示通過體外構建Foxp3表達載體可直接活化Treg細胞，促進其功能的發揮。

早期有研究提示Treg細胞及NKT細胞在哮喘發病過程中存在相互調控作用[10-11]。故而本實驗通過體外共培養Treg細胞和NKT 細胞，研究Treg細胞對NKT細胞功能的影響。Transwell共培養的結果顯示，轉染Foxp3后，遷移到下室的NKT細胞數量明顯減少，提示活化的Treg細胞可抑制NKT細胞的遷移；此外RT-PCR和ELISA的檢測結果顯示，轉染Foxp3后，共培養體系上清液中IL-4和IFN-γ的水平顯著降低，結果提示活化的Treg細胞可抑制NKT細胞的活化。這些結果直接證實了Treg活化后可負調控NKT細胞，與前期的研究具有一致性。此外，哮喘發病過程中存在NKT細胞在不同組織器官之間的遷移/重新分布[15-18]，但目前尚不清楚這一現象是否與Treg細胞有關。為進一步觀察在哮喘發病過程中Treg細胞對NKT細胞的調控作用，本實驗研究引入OVA致哮喘小鼠模型，體內研究Treg細胞對NKT細胞體內分布的影響。結果顯示，表達Foxp3可顯著減少OVA致哮喘小鼠肺組織中NKT的數量，而增加外周血及脾臟中NKT的數量。提示活化Treg細胞可調控哮喘小鼠體內NKT細胞的分布。但是Treg細胞調控NKT細胞的具體作用機制還有待進一步深入的研究。

綜上所述，Foxp3病毒載體修飾可活化體外培養的Treg細胞，而活化的Treg細胞可抑制NKT細胞的活化及體外遷移并影響OVA哮喘模型小鼠NKT細胞的體內分布。