敲減CDKL5對人膠質母細胞瘤細胞生長和細胞周期的影響

張驚宇， 丁 婧， 鄭永慧， 初婷婷， 趙琳琳， 楊濱瑞， 高 騰

X染色體連鎖基因CDKL5(cyclin-dependent kinase-like 5，周期蛋白依賴型激酶樣5)基因編碼一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，故又名STK9(serine-threonine kinase 9)。CDKL5的基因突變可導致Rett綜合征等神經類疾病，因此目前的研究重點聚焦于CDKL5在神經元中的功能以及與雷特綜合征等神經系統疾病的關聯上[1]，但CDKL5基因在膠質瘤[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]、黑素瘤[5]和結腸癌[6]中有錯義突變和同義突變。CDKL5是白血病抗原之一，經常在成人T淋巴細胞白血病中高表達，可作為腫瘤免疫治療的靶標[7]。目前，對于CDKL5的功能性研究較少，CDKL5的表達隨神經瘤細胞的分化而不斷上調，本研究主要敲除人膠質母細胞瘤細胞U87中的CDKL5，發現敲減后顯著抑制U87的細胞增殖，使細胞周期發生停滯，這可以為之后CDKL5作為腫瘤治療的靶點提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 載體pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA(紐恩生物科技公司)、細胞培養板(美國corning)、所有培養基及添加劑(美國Gibco)、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)、MTT即3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，中文名3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(上海生工公司)、細胞周期檢測試劑盒(美國，sigma)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人膠質母細胞瘤細胞系U87使用MEM培養基，添加10%胎牛血清、1% Glutamax和1%青霉素+鏈霉素、1%非必需氨基酸和1%(1 mmol)丙酮酸鈉。細胞均置于37 ℃恒溫培養箱中培養，濕度100%，CO2濃度5%。

1.2.2 質粒構建 利用慢病毒感染人膠質母細胞瘤細胞U87同時導入CDKL5 shRNA，構建CDKL5 shRNA所用的載體為pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。實驗涉及的shRNA序列為shCDKL5 R：5’-3’CCGGGGAGCCTATGGAGTTGTAC TTCAAG；F：5’-3’ AGAGTACAACTCCATAGGCTCCTTTTTTG。質粒委托紐恩生物技術公司包裝制成慢病毒顆粒濃縮液。

1.2.3 蛋白免疫印跡 分別提取細胞蛋白和組織蛋白，BCA定量后(碧云天)進行蛋白免疫印跡檢測，上樣量為45 μg/孔。蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上(200 mA電流，室溫轉膜2 h)，用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h，將稀釋后的一抗稀釋液敷于膜上，4 ℃過夜。清洗一抗3遍后，1000∶1加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗，室溫孵育1 h，清洗二抗后，用ECL化學發光反應進行顯色。在暗室中將X光片放入膜上曝光,再進行顯影、定影反應。將膠片進行掃描，用Image J軟件測定蛋白條帶灰度,復制數據到Excel表中分析蛋白表達量差異。

1.2.4 MTT分析 MTT粉末用D’Hanks配成5 mg/ml的溶液，濾膜過濾，4 ℃避光保存。 慢病毒感染4 d后，消化細胞，通過細胞計數，制備1×104/ml的細胞懸液。在96孔培養板的每孔中加入150 μl懸液，即1500個細胞/孔。自4 h細胞貼壁始，每隔24 h在一個培養板的每個孔中加入15 μl的MTT溶液，共5 d。37 ℃孵育4 h。吸去培養基，加入150 μl DMSO，在酶標儀測定490 nm波長下的吸光值。此絕對吸光值減去對應DMSO的吸光值，為相對吸光值。

1.2.5 細胞周期分析 收集細胞加入2 ml -20 ℃預冷的70%乙醇，重懸，-20 ℃固定過夜。離心后棄上清，用50 μg/ml(Thermo Scientific公司)重懸細胞沉淀，37 ℃孵育30 min。1 mg/ml的碘化丙啶儲存液(Sigma-Aldrich公司)按1∶20加入到細胞懸液中，37 ℃避光孵育30 min。用BD FACSCalibur流式細胞儀(BD Bioscience公司)檢測，每個樣品檢測10000個細胞。FlowJo軟件分析DNA倍體(FLH2通道熒光強度)和細胞數，即細胞周期分布。

1.3 統計學分析 SPSS 18.0軟件進行統計學處理，t檢測分析組間的顯著性差異。P<0.05表示有顯著性差異。

2 結 果

2.1 CDKL5在人膠質母細胞瘤細胞系U87中的表達情況 由結果所示，在U87細胞系中CDKL5分為2個亞型，在細胞核和胞質中均有表達(見圖1A)；通過shRNA 敲減CDKL5的可以有效降低細胞質內的CDKL5的表達(見圖1B)；敲減CDKL5后細胞形態發生顯著變化，由原來長梭形變得不規則(見圖1C)。

2.2 敲減CDKL5抑制膠質母細胞瘤細胞的體外生長 通過血細胞計數，我們發現，敲減CDKL5會顯著抑制細胞增殖，MTT分析顯示，敲減CDKL5抑制U87細胞的活性降低(見圖2A)；流式細胞術實驗顯示，敲減CDKL5后U87細胞的進程被阻止在G2/M期(見圖2B)。

A.膠質母細胞瘤細胞中不同CDKL5蛋白亞型在細胞漿和細胞核中的分布；B.蛋白免疫印跡檢測人膠質母細胞瘤細胞系U87中CDKL5蛋白的表達。細胞表達有對照shRNA(Control)或敲減CDKL5的shRNA(shCDKL5)；C.敲減 CDKL5 引起膠質母細胞瘤細胞形態的改變。 放大倍數，×200；標尺， 50 μm

圖1 CDKL5在人膠質母細胞瘤細胞系U87中的表達

A.血細胞技術法分析細胞增殖和MTT法檢測細胞活性；B.流式細胞儀檢測細胞周期分布

3 討 論

此前研究發現，神經母細胞瘤中的CDKL5是抑癌蛋白。神經母細胞瘤SH-SY5Y中，過表達CDKL5將細胞周期阻滯在G0/G1期而抑制細胞增殖，同時促進細胞向神經元方向分化，而敲減CDKL5則產生相反的表型[8～10]。然而，此研究的初衷并非為了考察腫瘤中CDKL5的表達和功能，而是仍然關注CDKL5與神經疾病的關系。我們認為這些結果表明CDKL5能促進神經前體細胞的分化和神經元的成熟，并結合文獻推測CDKL5可能通過阻滯細胞周期、抑制細胞周期蛋白來促進分化的[11～13]。或許是膠質細胞中CDKL5低表達的緣故，至今未有研究關注CDKL5對膠質細胞成熟的影響和在膠質瘤發展中的作用。本研究發現，CDKL5蛋白具有多個亞型，前期也有相關報道，CDKL5的亞型分類與定位[14,15]。我們發現亞型之一的CDKL585在膠質母細胞瘤細胞U87的細胞質中高表達，敲減CDKL5后抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖。后期我們可以檢測在神經膠質母細胞瘤組織中CDKL5的表達情況與腫瘤特性的相關性，我們的研究可以為以后膠質母細胞瘤的治療提供新的理論基礎。