慢性酒精攝入通過NO信號通路影響小鼠的運動協調功能

金海燕， 金光林， 董光輝， 崔松彪

酒精，又名乙醇(Ethanol)，是最常被濫用的藥物之一。當血液中的酒精濃度超過1000 mg/L時，人就有明顯的酒精中毒癥狀，如興奮、走路不穩、嗜睡、麻醉等。小腦是酒精的重要靶點。小腦參與動物控制運動協調、計劃、自主運動的精細調節和認知功能。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種逆行信使分子，在中樞神經系統中廣泛存在，與多種神經系統疾病的發病機制有關[1]。N’-硝基-L-精氨酸(NG-Nitro-L-arginine，L-NNA)是NO合成酶抑制劑。它能夠抑制體內合成的NO，從而抑制NO升高所帶來的效應。大麻素1受體(Cannabinoid type 1，CB1)分布在腦、脊髓與周圍神經中，它與動物的記憶、認知、運動協調等功能方面有關系[2]。在20世紀70～80年代發現，運動學習在一定程度上是在小腦中完成的，且作為一種從適應性控制系統來發揮這一功能[3]。慢性酒精攝入引起的運動行為障礙與腦內NO水平變化有關系，而CB1受體則不參與其中。NO主要在小腦分子層通路中產生，CB1受體也在小腦浦肯野細胞層大量分布[4]。

國內外對急性及慢性酒精對神經系統的研究較多，但對NO信號通路與CB1受體是否參與慢性酒精攝入帶來運動行為損傷的研究尚少。本研究主要通過行為學測驗方法觀察慢性酒精攝入對小鼠運動協調能力的影響，觀察慢性酒精攝入對運動行為的影響是否與NO信號通路與CB1受體有關，為探索慢性酒精攝入對小鼠運動協調功能的影響機制提供研究方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用6～8周齡，且體重控制在29 g～30 g的ICR小鼠50只，均使用雄性小鼠，由延邊大學實驗動物中心提供。自由攝食及飲水。本實驗的所有操作均未違背國際動物保護條例，并接受延邊大學動物保護委員會的監督。

1.2 主要實驗器材與材料 行走障礙分析儀，轉棒儀，酒精，氯化鈉，N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA)，大麻素1受體抑制劑(AM251)。

1.3 實驗動物準備 將小鼠分為5組，即對照組、酒精攝入低劑量組、酒精攝入高劑量組、酒精攝入高劑量+L-NNA組和酒精攝入高劑量+AM251組(每組n=10)，并用染毛試劑做好標記。建立動物模型，即對照組腹腔注射9 g/kg生理鹽水，低劑量組注射0.8 g/kg酒精，高劑量組注射1.6 g/kg酒精，每組注射周期為28 d。每日上午同一時間段注射，每組注射周期為28 d，起始體重為29 g～30 g。

1.4 行走障礙分析測試 各組模型小鼠腹腔注射結束后第1天，分別將每組小鼠放到行走障礙分析儀上，讓小鼠在無任何刺激下主動在行走障礙分析儀上跑動，行走障礙分析儀器的77個傳感棒自動記錄小鼠步態錯誤，并自動統計出每根傳感棒上的錯誤次數及時間。每只小鼠測試5次，取5次測試的總錯誤次數及時間來進行分析。

1.5 加速轉棒運動測試 各組模型小鼠腹腔注射結束后第一天，將對照組、低劑量組、高劑量組小鼠進行轉棒儀測試。加速模式設定為滾輪的轉速在300 s內從4 rpm加速到40 rpm[5]。當小鼠在某個轉速下不能被動行走時會掉落，轉棒儀自動記錄小鼠在轉棒儀上持續的時間和掉落時的速度。每只小鼠測3次后取平均值。最后將所有小鼠的持續時間和速度一起進行分析。

1.6 檢測慢性酒精攝入是否與NO和CB1受體有關 取20只小鼠，分為兩組，先按高劑量濃度酒精注射28 d后的第1天上午分別腹腔注射1 mg/kg劑量的一氧化氮氧合酶抑制劑(L-NNA)和10 mg/kg劑量的大麻素受體1(CB1)受體抑制劑(AM251)，然后分別在行走障礙分析儀和轉棒儀上測試。研究L-NNA和AM251對酒精攝入引起的運動協調性損傷的影響。

1.7 測試酒精攝入影響的消退時間 將高劑量組的小鼠10只，在結束腹腔注射酒精后的1 d、1 w、2 w、3 w時分別按上述方式在行走障礙分析儀和轉棒儀上測試。

2 結 果

2.1 慢性酒精攝入對行走運動協調的影響 經過28 d的酒精攝入，我們利用行走障礙分析儀觀察了酒精對行走運動的影響。長期酒精攝入后，可劑量依存地增加四肢行走的錯誤率。典型例子(見圖1A、B)，1例酒精高劑量組小鼠四肢在一次測試中一共出現3次錯誤，錯步共持續48 ms，分別出現在第13和38傳感棒上。酒精低劑量(0.8 g/kg)組小鼠四肢(見圖1C)和前肢(見圖1E)行走錯誤次數顯著高于對照組(P<0.05)；而高劑量(1.6 g/kg)組小鼠四肢(見圖1C)和前肢(見圖1E)行走錯誤次數顯著高于低劑量組(P<0.05)。此外， 酒精攝入不僅增加四肢行走錯誤次數，而且顯著增加錯步持續時間，低劑量組小鼠四肢(見圖1D)和前肢(見圖1F)行走錯步持續時間顯著長于對照組(P<0.05)，而高劑量組小鼠四肢(見圖1D)和前肢(見圖1F)行走錯步持續時間顯著高于低劑量組(P<0.05)。

2.2 慢性酒精攝入對平衡調節的影響 經過28 d的酒精攝入，利用轉棒儀觀察了酒精對平衡調節的影響。長期酒精攝入后，可劑量依存地縮短小鼠在加速轉棒上的持續時間，同樣，掉落時的轉速也劑量依存地減慢。低劑量組小鼠在加速轉棒上的持續時間顯著短于對照組(P<0.05)；而高劑量組小鼠在加速轉棒上的持續時間短于低劑量組(P<0.05)(見圖2A)。低劑量組小鼠掉落時的轉速顯著慢于對照組(P<0.05)；而高劑量組小鼠掉落時的轉速慢于低劑量組(P<0.05)(見圖2B)。

2.3 NO合成酶抑制劑對酒精攝入引起的行走運動損傷的影響 在高劑量酒精攝入結束后的第一天小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑(L-NNA)，然后利用行走障礙分析儀觀察了NO合成酶抑制劑對慢性酒精攝入引起的行走運動損傷的影響。給高劑量組小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑后發現，能減少高劑量組小鼠四肢行走的錯誤率。典型例子(見圖3A、B)，1例酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢在一次測試中一共出現一次錯誤，錯步共持續16 ms，出現在第27個傳感棒上。酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢(見圖3C)行走錯誤次數顯著低于高劑量組(P<0.05)；酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢(見圖3D)錯步持續時間顯著短于高劑量組(P<0.05)。

2.4 NO合成酶抑制劑對酒精攝入引起的平衡調節損傷的影響 在高劑量酒精攝入結束后的第一天小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑(L-NNA)，然后利用轉棒儀觀察了NO合成酶抑制劑對慢性酒精攝入引起的平衡調節損傷的影響。小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑后也發現，能延長高劑量組小鼠在轉棒上的持續時間。酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠在加速轉棒上的持續時間(見圖4A)顯著長于高劑量組(P<0.05)；酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠掉落時的轉速(見圖4B)顯著快于高劑量組(P<0.05)。上述結果表明，NO合成酶抑制劑能夠改善酒精攝入對行走運動損傷作用。

2.5 抑制CB1受體對酒精攝入引起的行走運動損傷的影響 在高劑量酒精攝入結束后的第一天小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑(AM251)，然后利用行走障礙分析儀觀察了CB1受體抑制劑對酒精攝入引起的行走運動損傷的影響。典型例子(見圖5A、B)，1例酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢在一次測試中一共出現兩次錯誤，錯步共持續48 ms，分別出現在第33和60傳感棒上。給高劑量組小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑后發現，不能減少高劑量組小鼠四肢行走的錯誤率，酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢(見圖5C)行走錯誤次數與高劑量組沒有差異(P>0.05)；酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢(見圖5D)錯步持續時間與高劑量組沒有差異(P>0.05)。上述結果表明，CB1受體阻斷劑不能改善酒精攝入對行走運動的損傷作用。

2.6 抑制CB1受體對酒精攝入引起的平衡調節損傷的影響 在高劑量酒精攝入結束后的第1天小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑(AM251)，然后利用轉棒儀觀察了CB1受體抑制劑對酒精攝入引起的運動協調損傷的影響。給高劑量組小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑后發現，不能延長高劑量組小鼠在轉棒上的持續時間，酒精攝入高劑量+AM251組小鼠在加速轉棒上持續時間(見圖6A)與高劑量組沒有差異(P>0.05)；酒精攝入高劑量+AM251組小鼠掉落時的轉速(見圖6B)與高劑量組沒有差異(P>0.05)。上述結果表明，CB1受體阻斷劑不能改善酒精攝入對平衡調節的損傷作用。

2.7 慢性酒精攝入引起運動協調功能損傷的消退過程 在酒精攝入高劑量組小鼠停止酒精攝入后1 d(0 w)、1 w、2 w、3 w時的行走障礙分析測試及加速轉棒測試結果表明：小鼠四肢行走錯誤次數及錯步持續時間逐漸減少(見圖7A、B)，3 w后消失，行走運動功能恢復到酒精攝入前水平(P<0.05)；小鼠在加速轉棒上的持續時間及掉落時的轉速逐漸延長及加快(見圖7C、D)，3 w后恢復到酒精攝入前水平(P<0.05)。綜上所述，長期酒精攝入引起運動協調功能的損傷作用隨著酒精攝入的停止可逐漸消退，恢復到酒精攝入前水平。

A：1例高劑量組小鼠在一次測試中的四肢行走錯誤次數；B：1例高劑量組小鼠在一次測試中的四肢行走錯步持續時間；C：不同劑量酒精攝入對四肢行走錯誤次數的影響；D：不同劑量酒精攝入對四肢行走錯步持續時間的影響；E：不同劑量酒精攝入對前肢行走錯誤次數的影響；F：不同劑量酒精攝入對前肢行走錯步持續時間的影響。與對照組相比*P< 0.05；與低劑量組比較#P<0.05

圖1 慢性酒精攝入對行走運動協調的影響

A：不同劑量酒精攝入對小鼠在轉棒儀上的持續時間的影響；B：酒精攝入對小鼠從轉棒儀上掉落時轉速的影響。與對照組相比*P<0.05；與低劑量組比較#P<0.05

圖2 慢性酒精攝入對平衡調節的影響

A：NNA組小鼠在1次測試中的四肢行走錯誤次數；B：1例L-NNA組小鼠在1次測試中的四肢行走錯步持續時間；C：對照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組的四肢行走錯誤次數；D：對照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組的四肢行走錯步持續時間。與高劑量組比較#P<0.05

圖3 NO合成酶抑制劑對酒精攝入引起的行走運動損傷的影響

A：對照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組小鼠在轉棒儀上的持續時間；B：對照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組小鼠從轉棒儀上掉落時的轉速。與高劑量組比較#P<0.05

圖4 NO合成酶抑制劑對酒精攝入引起的平衡調節損傷的影響

A：1例AM251組小鼠在一次測試中的四肢行走錯誤次數；B：1例AM251組小鼠在一次測試中的四肢行走錯步持續時間；C：對照組、酒精攝入高劑量組和AM251組的四肢行走錯誤次數；D：對照組、酒精攝入高劑量組和AM251組的四肢行走錯步持續時間。與高劑量組比較#P>0.05

圖5 抑制CB1受體對酒精攝入引起的行走運動損傷的影響

A：對照組、酒精攝入高劑量組和AM251組小鼠在轉棒儀上的持續時間；B：對照組、酒精攝入高劑量組和AM251組小鼠從轉棒儀上掉落時的轉速。與高劑量組比較#P>0.05

圖6 抑制CB1受體對酒精攝入引起的平衡調節損傷的影響

A：停止酒精攝入后，四肢行走錯誤次數的消退過程；B：停止酒精攝入后，四肢行走錯誤持續時間的消退過程；C：停止酒精攝入后，小鼠在轉棒儀上的持續時間逐漸延長的過程；D：停止酒精攝入后，小鼠掉落時的轉速逐漸增快的過程。與停止注射酒精后1 d(0 w)比較#P<0.05

圖7 慢性酒精攝入引起運動協調功能損傷的消退過程

3 討 論

本實驗主要通過建立不同劑量的慢性酒精攝入的模型小鼠，利用行走障礙分析儀和轉棒儀觀察慢性酒精攝入對運動協調的影響，觀察酒精攝入引起的運動協調損傷作用與酒精攝入停止的關系;觀察NO氧合酶抑制劑和CB1受體抑制劑對酒精攝入引起的運動協調損傷的影響。本研究的結果主要發現慢性酒精攝入可劑量依存地導致小鼠的步態錯誤次數和錯步持續時間顯著增加，在轉棒上的持續時間明顯縮短，對轉棒儀的轉速要求明顯減小，提示酒精攝入對運動協調的損傷作用具有劑量依存性。然而值得注意的是：腹腔注射NO合成酶抑制劑改善酒精攝入對運動協調的損傷作用，顯著減少步態錯誤次數和錯步持續時間降低，明顯增加轉棒上持續時間及轉速。我們的研究成果表明慢性酒精攝入通過NO信號通路損傷小鼠運動調節功能。

事實上，酒精對大腦功能的影響主要發生在低濃度到100 mmol的范圍內[6]，且低濃度酒精的作用在人和動物身上表現不同[7]。慢性酒精暴露和酒精使用障礙對社會的負面影響較大，包括人際關系的不協調、失業、精神癥狀、肝功能衰竭和嚴重的認知障礙[8]。酒精攝入引起的運動協調、平衡、行為、言語和認知功能的改變被認為一部分是由小腦功能受損所介導的[9]。在本實驗結果顯示酒精可劑量依存地損傷運動行為功能，此結果與Laurent Servais等研究的結果一致[10]，表明慢性酒精攝入對運動協調功能損傷有顯著影響，它的影響表現在主動性和被動性的行走功能。慢性酒精中毒導致的肢體震顫及行走不穩等癥狀甚至可持續到清醒后狀態。本實驗結果表明：慢性酒精攝入可劑量依存地導致小鼠的步態錯誤次數和錯步持續時間顯著增加，在轉棒上的持續時間明顯縮短，對轉棒儀的轉速要求明顯減小，提示酒精攝入對運動協調的損傷作用具有劑量依存性。

酒精可通過直接增強外源性GABAA受體發揮作用，也可通過抑制鈉鉀依賴式ATP酶、鉀通道和神經元一氧化氮合酶，間接地增加自發性高爾基細胞的放電[11]。在體內條件下，長期系統地給予酒精會導致NO水平的劑量依賴性增加，說明酒精的消耗可能導致NO水平的增加。它還可以促進細胞毒性的形成，如過氧化亞硝酸鹽的形成，可能與高度損害蛋白質和細胞膜有關[12]。本實驗結果表明，長期腹腔注射高劑量酒精的小鼠注射了L-NNA后，發現其對運動行為的改變明顯好轉，從而說明酒精的消耗引起NO水平的升高，且NO水平的上升與運動行為損傷機制有關。CB1受體在小腦、基底核有分布，它也參與共濟失調、不隨意運動等，由此可猜想慢性酒精攝入帶來的運動行為障礙可能與CB1受體相關。然而，本實驗中發現，當給高劑量組小鼠注射CB1受體抑制劑后，并未發現小鼠運動行為得以改善。這能間接說明，腦消耗酒精導致運動行為損傷時并沒有CB1受體參與其中。

綜上所述，本研究發現慢性酒精攝入可劑量依存地損傷運動協調功能，腹腔注射NO合成酶抑制劑能夠改善酒精攝入對運動協調的損傷作用，顯著減少步態錯誤次數和降低錯步持續時間，明顯增加轉棒上持續時間及轉速。本研究結果表明慢性酒精攝入是通過NO信號通路來損傷小鼠運動調節功能。