洛伐他汀對同型半胱氨酸硫內酯誘導的HUVECs中IL-1和IL-6的表達影響分析

黃寧江（通訊作者） 黃仕芳 姜卓 胡昊良 徐嬋

（1永州職業技術學院 湖南 永州 425000）

（2永州市第一人民醫院 湖南 永州 425000）

（3湖南師范大學生命科學學院 湖南 長沙 41081）

高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是導致心腦血管疾病的獨立危險因素之一[1-2]。目前認為HHcy與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、血栓性疾病密切相關，但是HHcy導致AS的發病機制目前尚不清楚。研究發現，HHcy致病的病理學基礎主要與同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）在體內轉變成同型半胱氨酸硫內酯（homocysteine thiolactone，HTL）有關[3]，HTL能導致血管損傷，但具體機制尚未明確。他汀類藥物是臨床常用治療高膽固醇血癥的藥物，除了有調血脂的作用外，還具有改善內皮功能[4]、抗血管炎癥等非調脂性作用。文獻報道，他汀類對HHcy引起的血管內皮功能損傷有保護作用。洛伐他汀（lovastatin，LVT）是臨床用于治療高膽固醇血癥的他汀類藥物之一，本課題組在前期實驗中發現LVT可顯著減輕HTL對EDR的抑制作用，減少血管組織中丙二醛的生成和保護SOD的活性，但LVT對HTL所致血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VEC）損傷的保護作用及機制目前尚不清楚。本研究將在前期工作的基礎上進一步探討LVT對HTL所致血管內皮細胞損傷的保護作用，也為他汀類藥物抗AS作用提供新的依據。

1.資料與方法

1.1 主要試劑

人臍靜脈內皮細胞株（HUVECs）購自中國典型培養物保藏上海中心細胞庫；LVT、HTL和DMEM培養基等均購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。熒光定量PCR引物（IL-l序號為Hs00174097，IL-6序號為Hs00l74131，GAPDH序號為4326317E-0503008）均購Applied Biosystems公司。蛋白定量檢測（BCA）試劑盒、蛋白裂解液、IL-1和IL-6單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗分組與細胞培養

HUVECs用含10%胎牛血清的F12K培養基在37℃條件下用含5%CO2的孵箱培養。當HUVECs長到對數期時換成含0.5%FBS的F12K培養基預處理24h使HUVECs出現同步化，然后用于下一步的實驗研究。本實驗共分為對照組、HTL處理組（1mmol/L的HTL處理24h）和低濃度LVT處理組（先用0.025μmol/L的LVT預處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）、中濃度LVT處理組（先用0.05μmol/L的LVT預處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）和高濃度LVT處理組（先用0.1μmol/L的LVT預處理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL處理24h）。

1.3 細胞內活性氧（ROS）含量測定

各組處理后的HUVECs細胞用胰酶進行消化（0.125%的胰酶與0.02%的EDTA比例為1∶1），然后用無血清的F12K培養基洗3次，并用PBS重懸細胞（4×108/L）。加入用1μL無水乙醇配置的DCFH-DA，于37℃避光水浴30分鐘。采用儀器檢測各組HUVECs細胞的活性氧含量。

1.4 Western Blotting分析IL-1和IL-6蛋白表達水平

收集各組HUVECs后加入4℃預冷的細胞裂解液裂解細胞收取總蛋白，各組的蛋白濃度采用BCA法進行測定。每孔上樣蛋白量為30μg，用SDS-PAGE膠進行電泳，轉膜后用無脂奶粉（5%）于常溫下封閉1h。加入不同濃度稀釋的抗IL-1、IL-6和GAPDH等一抗，在4度下搖床過夜。用1∶5000稀釋的HRP標記的二抗于室溫下孵育1h，應用化學發光試劑顯色，對膠片進行定影和顯影，最后對膠片掃描并進行灰度分析。

1.5 統計學分析

采用SPSS15.0統計軟件對數據進行分析，以均數±標準差（±s）表示，組間的統計比較應用t檢驗，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）對多組間數據進行比較分析，P＜0.05被認為具有統計學意義。

2.結果

2.1 LVT抑制HUVECs中HTL誘導的ROS的生成

與對照組相比，HTL能明顯誘導HUVECs細胞內ROS生成（P＜0.05）；與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應（P＜0.05），見圖1。

圖1 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導的ROS

2.2 LVT抑制HUVECs中HTL誘導的IL-1的表達

與對照組相比，HTL能明顯誘導HUVECs細胞中IL-1表達；與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應（P＜0.05），見圖2。

圖2 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導的IL-1

2.3 LVT抑制HUVECs中HTL誘導的IL-6的表達

與對照組相比，HTL能明顯誘導HUVECs細胞中IL-6表達與HTL組相比，LVT可呈濃度依賴性抑制HTL所致的效應（P＜0.05）見圖3。

圖3 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL誘導的IL-6

3.討論

文獻報道，HTL可通過直接以及間接這兩種途徑影響血管內皮功能。HTL的酐鍵可與血漿蛋白的賴氨酸ε-氨基起作用，從而改變蛋白的結構以及理化性質。間接途徑與HTL影響細胞內信號通路激活有關，可能與HTL促進脂質過氧化物和細胞內ROS生成有關，但具體的分子機制目前尚未清楚。在本研究中，我們取HTL處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）復制內皮細胞損傷模型，將HUVECs分為對照組、HTL處理組、低濃度LVT處理組、中濃度LVT處理組和高濃度LVT處理組，用Westernblot檢測HTL及LVT對HUVECs中IL-1和IL-6表達的影響。結果發現，HTL可明顯增加HUVECs內ROS生成，同時可使IL-1和IL-6的蛋白表達水平均明顯增高，而LVT可呈濃度依賴性抑制HTL誘導的HUVECs中IL-1、IL-6的表達。

動脈粥樣硬化是一種脂質代謝失調以及炎癥性血管病變，AS的發生進展過程中均伴有炎癥反應，大量研究表明有許多炎癥因子以及炎癥細胞參與了AS的形成，如高水平的急性反應蛋白和IL-6可促使AS斑塊的形成。研究中，我們發現LVT可通過下調HTL誘導的HUVECs中IL-1和IL-6的表達，參與細胞炎癥反應的調節，從而推測他汀類藥物可能通過減輕炎癥反應，保護血管內皮細胞抑制AS的形成和發展，其精確的機制尚有待進一步的研究。該研究手段為研究HHcy致病機制提供了新的方法，其結果也為他汀類藥物的抗AS作用提供新的依據。