等電點沉淀法提取牡蠣蛋白及其蛋白組成分析

姜燕蓉，張亞飛，齊筱瑩，王丹妮，田茂鴻，趙 慧

(大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116623)

牡蠣(又稱海蠣子)是軟體動物門、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科的雙殼貝類，是世界第一大養殖貝類，也是中國養殖產量最大的經濟貝類[1]。牡蠣含有糖原、維生素、牛磺酸和銅、鐵、鋅等微量元素，其營養成分豐富。而且牡蠣中蛋白質含量較高，可以作為良好蛋白質來源[2-3]。但是，目前我國對牡蠣各部分的加工利用研究較少，對其蛋白質的相關性質也尚不清楚，使得牡蠣的合理加工和高值化應用受到一定的限制。

等電點沉淀法是通過在較低pH值或較高pH值條件下使蛋白質溶解，通過離心或過濾將其與不溶性物質(骨骼、皮膚或脂質)分離，然后使其在等電點下沉淀獲得高含量蛋白質的過程[4]。蛋白質中的氨基酸在pH值變化時會發生一定程度的電離，導致其在溶液中的溶解度發生變化[5]。相比較鹽析法、有機溶劑萃取法和酶水解法等其他蛋白質提取分離方法，等電點沉淀法具有蛋白質回收率高、蛋白質變性程度小、安全性較好等優點[6]。不同來源的分離蛋白因含有的氨基酸不同導致其溶解和沉淀pH值不相同。魷魚和鳙魚蛋白在pH值為3和11的條件下溶解，當pH值為5.5時沉淀獲得的分離蛋白提取率分別高達75%和79%[7-8]。在料液比1∶9、溶解pH值2.0～3.0和12.0～13.0、沉淀pH值5.5條件下，斑節對蝦蛋白提取率為75.67%～82.72%[9]。

本研究以牡蠣為原料，將等電點沉淀法應用于牡蠣蛋白的制備，通過優化提取溫度、溶解pH、提取時間和沉淀pH四個主要影響因素，確定牡蠣蛋白制備的最佳堿溶工藝條件，并對牡蠣中各蛋白組分進行了分析，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定了其分子質量分布，以期為進一步加工利用牡蠣蛋白提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料處理與試劑

牡蠣(大連灣牡蠣，Ostreamtailienwhanensis)，購于大連黑石礁海鮮市場，新鮮貝肉去殼去內臟，清洗干凈，勻漿后冷凍干燥得到牡蠣凍干粉；混合蛋白質標準品：Takara寶生物工程有限公司；NaOH、乙醇、三氯乙酸等試劑：均為分析純。

1.2 儀器設備

BS-224S分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；BL25B36勻漿機：廣東美的生活電器制造有限公司；SYG-2恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；H-1850R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-721E 721分光光度計：上海光譜儀器公司；KDN-08消化爐：金壇市指前鎮旭日實驗儀器廠；馬弗爐；JJ-1磁力攪拌：常州國華電器有限公司；PHS-25 pH計：上海雷磁儀器有限公司；MD 77透析袋(MW：12～14 kDa)：美國聯合碳化物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本成分的測定

水分含量的測定：GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》，直接干燥法；

灰分含量的測定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》，灼燒稱重法；

粗蛋白質含量的測定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》，微量凱氏定氮法；

粗脂肪含量的測定：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》，索氏抽提法；

總糖含量的測定：GB 5009.7—2016《食品中總糖的測定》，苯酚硫酸法；

1.3.2 最佳堿溶工藝優化

對Palafox H等[7]的方法稍作修改，進行牡蠣分離蛋白的制備。

稱取一定質量牡蠣凍干粉，加入蒸餾水溶解后(料液比1∶3)均質化，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取分離蛋白，4℃、9 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定蛋白質含量。固定堿溶提取條件為提取溫度25℃、溶解pH值11.0、提取時間1.5 h。本文考察了提取溫度(10、20、30、40、50、60、70、80℃)、溶解pH值(9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)和提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)三種因素對堿溶過程中牡蠣分離蛋白溶解性的影響。

1.3.3 最佳沉淀pH值工藝優化

通過1.3.2條件制備蛋白提取液后，用0.1 mol/L HCl調節溶液將pH值調節為3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，在4℃下放置1 h后，4℃、8 000 r/min離心15 min，分別收集沉淀和上清液，上清液采用100 mL容量瓶定容，進行蛋白質含量的測定，從而確定最佳酸沉pH值。

1.3.4 牡蠣蛋白組分分離

參照Osborne分級法[10]對牡蠣勻漿中四種蛋白質進行分級分離。

1)采用500 mL蒸餾水溶解100 g牡蠣凍干粉→室溫攪拌2 h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀重復水提2次，合并2次上清液→冷凍干燥→水溶性蛋白。

2)在1)所得的沉淀中加入1 000 mL 50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液(含500 mL 0.5 mol/ L NaCl)進行溶解→室溫攪拌2 h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀中加500 mL 0.5 mol/L NaCl提取→合并2次上清液→4℃、去離子水中透析(MWCO：8 000 Da)72 h→蛋白質離心→沉淀進行冷凍干燥→鹽溶性蛋白。

3)在2)所得的沉淀中加入1 000 mL 45%的乙醇進行溶解→室溫攪拌2 h→ 4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀加入500 mL 45%的乙醇后離心→合并2次上清液→濃縮→冷凍干燥→醇溶性蛋白。

4)在3)所得的沉淀中加入1 000 mL 0.05 mol/L NaOH進行溶解→室溫攪拌2 h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀中加入500 mL 45% NaOH后離心→合并上清液，邊攪拌邊向其中滴加20%(W/V)三氯乙酸，至三氯乙酸的最終濃度為5%(W/V)→4℃、10 000 r/min離心20 min→沉淀用預冷的丙酮洗滌三次→熱風干燥→堿溶性蛋白。

1.3.5 牡蠣各蛋白組分分析

蛋白質含量的測定根據GB 5009.5—2016，蛋白質轉換系數為6.25，其中：

1.3.6 牡蠣各蛋白組分SDS-PAGE電泳測定

用5% SDS將1.3.3和1.3.4得到的蛋白質溶解，然后用上樣緩沖液(β-巰基乙醇)處理樣品，采用R250考馬斯亮藍進行染色。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為5%濃縮膠、12%分離膠。通過Gel-Pro Analyzer分析軟件對電泳圖譜進行分析。

1.3.7 統計與分析

所有實驗均重復三次，實驗結果采用平均值±標準偏差的方式進行表述。數據采用SPSS 22.0和Excel進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 牡蠣基本成分組成

牡蠣的基本成分組成結果如表1所示。新鮮牡蠣中水分含量為81.42%，牡蠣凍干粉中粗蛋白含量達到57.21%，總糖含量為33.09%，粗脂肪含量為3.08%，灰分含量為6.48%。結果顯示牡蠣中含有豐富的蛋白質，這與邱娟等[11]研究的結果一致。在去內臟牡蠣中，還含有較高含量的灰分，是因為牡蠣中含有相當含量的礦物質元素，如Mg、Ca、Fe、Zn和Al等。

表1 牡蠣基本成分分析(干基)

2.2 等電點沉淀法提取牡蠣蛋白工藝優化

2.2.1 提取溫度對牡蠣蛋白含量的影響

提取溫度對牡蠣蛋白含量的影響如圖1所示。由圖所知，在10～80℃的溫度范圍內，牡蠣蛋白含量隨提取溫度的增加變化并不顯著。并且在高溫條件下提取蛋白質的含量并無顯著變化，與董淑華等[12]在4～50℃提取鳶烏賊蛋白結果一致。這可能是由于牡蠣蛋白并未發生變性，高溫可能只是使其部分蛋白質失活，所以對分離蛋白含量影響不大。因此，在室溫條件下進行提取操作即可。

2.2.2 溶解pH值對牡蠣蛋白含量的影響

溶解pH值對牡蠣蛋白含量的影響如圖2所示。由圖2可知，牡蠣蛋白的含量隨pH值的增加呈現先上升后下降的趨勢，當pH值為12.0時，牡蠣蛋白含量達到2.8%，之后蛋白質含量下降，可能是過高的pH值造成蛋白質變性，使其沉淀析出，從而使最后上清液中蛋白質含量降低。由此可知，pH值為12.0時，牡蠣蛋白溶解性較好，pH值過高、過低都會造成蛋白含量下降。因此根據實驗結果，選取pH值為12.0為最佳提取pH值。

2.2.3 提取時間對牡蠣蛋白含量的影響

提取時間對牡蠣蛋白含量的影響如圖3所示。根據圖3可知，當提取時間為0.5～1.0 h時，延長提取時間，溶液中牡蠣蛋白含量增加。當提取時間延長至1.0 h以后，其對牡蠣蛋白含量并無明顯影響。說明堿提1.0 h，堿溶體系達到平衡。因此選擇溶解時間為1.0 h。

2.2.4 沉淀pH值對牡蠣蛋白含量的影響

沉淀pH值對牡蠣蛋白含量的影響如圖4所示。當pH值為3.2～4.0時，溶液中蛋白質含量隨著pH值的增加呈現下降的趨勢，并在pH 值達到4.0時分離蛋白含量最低(0.66%)，pH值在4.0～6.5范圍內時，蛋白含量隨pH值增加而增加。以上結果說明蛋白最佳酸沉范圍在4.0～4.4之間。綜合考慮，選擇最佳酸沉pH值為4.0。

2.2.5 提取驗證試驗

綜合上述結果確定堿溶提取工藝：在室溫條件下，調整溶解pH值為12.0，堿提時間為1.0 h，離心后將上清液pH值調整至4.0，再次離心取沉淀。將沉淀通過8～12 kDa透析袋透析除鹽，冷凍干燥后得到牡蠣蛋白。在此條件下制備得到的牡蠣蛋白提取率為65.6%，蛋白純度為84.3%。陳麗等[13]采用有機溶劑萃取法提取12 h，得到褶牡蠣蛋白提取率僅為21.15%，遠低于等電點沉淀法提取牡蠣蛋白的提取率。等電點沉淀法可以有效提高牡蠣蛋白的提取率，為牡蠣產品高附加值加工和利用提供理論依據。

2.3 牡蠣蛋白的分離

去內臟牡蠣肉中富含蛋白質，為明確牡蠣蛋白各組分的含量特點及功能特性，利用傳統的Osborne蛋白分級方法，根據每種蛋白組分溶解特性的區別，提取得到四種蛋白組分結果如表2所示。

鹽溶性蛋白在肌肉中種類豐富，含量較多。主要由肌原纖維蛋白組成，包括肌球蛋白重鏈(MHC)、輕鏈(MYL)、肌動蛋白(Actin)和軟體動物特有的副肌球蛋白(PM)和相對分子質量較小的原肌球蛋白等[14]。在牡蠣蛋白中，鹽溶性蛋白提取率為49.82%，純蛋白組分占原料的18.51%，是牡蠣蛋白中優勢蛋白組分。水溶性蛋白主要指存在于肌肉細胞肌漿中的肌漿蛋白，主要成分是代謝相關的酶蛋白，如乳酸脫氫酶、醛縮酶、TG酶等，其成分較為復雜[15]。牡蠣肌肉中水溶性蛋白純蛋白組分占原料的8.82%，提取率為12.03%，相比較魚臺魚蛋白中水溶性蛋白的含量(76.12%)，牡蠣蛋白中水溶性蛋白含量較少[16]。堿溶性蛋白和醇溶性蛋白提取率分別為14.64%和7.42%，其純蛋白組分分別占原料的10.49%和1.44%。因此，牡蠣蛋白各級組分中含量依次為鹽溶性蛋白>堿溶性蛋白>水溶性蛋白>醇溶性蛋白。將該結果與張晶晶等對近江全牡蠣蛋白各組分含量分析結果[17]進行比較發現，全牡蠣蛋白中水溶性蛋白含量較高(37.79%)，而鹽溶性蛋白含量(31.10%)低于去內臟牡蠣(49.82%)，這可能是由于在去除內臟的過程中造成了內源性蛋白酶的大量損失，從而造成水溶性蛋白含量較低。

表2 牡蠣各蛋白組分的提取結果

注：提取率為3次提取得率平均值±SD。

Note：Values were shown as mean±standard deviation of three determinations.

2.4 牡蠣各級蛋白分子量分布

目前，SDS-PAGE技術已被廣泛應用于水產蛋白質分子量分布的研究[17-18]。本研究以β-巰基乙醇為上樣液，比較了經上樣液處理和未經上樣液處理的樣品差異性，并對等電點沉淀法提取的分離蛋白、鹽溶性蛋白、水溶性蛋白、堿溶性蛋白和醇溶性蛋白的分子量分布進行了分析，結果如圖5所示。

注：泳道M：Marker標準蛋白；泳道 1～5(經β-巰基乙醇處理的樣品)，依次為pH調節法制備的分離蛋白、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白；泳道 6～10(未經 β-巰基乙醇還原處理的蛋白樣品)，依次為pH調節法制備蛋白、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白。

Notes：Lane M：Marker standard protein；Lane 1 to 5(Samples were treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein，respectively；Lane 6 to 10(Samples were not treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein,respectively.

β-巰基乙醇能夠打開蛋白質的二硫鍵，使蛋白質中的亞基游離出來，所以通常經過β-巰基乙醇處理后的樣品電泳條帶比未經處理的樣品電泳條帶多[19]。通過等電點沉淀法制備的蛋白質樣品分子量分布比較分散，經上樣液處理后的蛋白在44.3 kDa處有明顯的條帶，而未經上樣液處理后的蛋白在97.2 kDa處有明顯的條帶。這可能是由于β-巰基乙醇使97.2 kDa處蛋白質二硫鍵打開釋放出亞基。

β-巰基乙醇處理后牡蠣鹽溶性蛋白分布范圍為200.0～250.0 、97.2～200.0、44.3 kDa三部分，所對應的蛋白種類為MHC、PM和Actin。這一結果與貽貝蛋白的電泳條帶分布情況[20]相似。但MHC和PM的電泳條帶顏色比較淺，說明蛋白含量不高。而未經上樣液處理的樣品中蛋白主要分布在20.1～40.3 kDa，且經上樣液處理的樣品中含有分子質量為14.3 kDa的泳道，在同類研究中發現類似特征的蛋白條帶，此條帶可能是貝類所具備的獨特蛋白結構[17]。

水溶性蛋白的分子量分布比較分散，此結果與曹文紅等[21]脊尾白蝦水溶性蛋白電泳分布結果類似，未經上樣液處理的水溶性蛋白在200.0～250.0、97.2與14.3 kDa處有明顯條帶，與之相比，上樣液處理后水溶性蛋白在200.0～250.0、44.3和14.3 kDa處有明顯的蛋白條帶；上樣液處理后醇溶性蛋白在44.3 kDa處有明顯的蛋白條帶，而未經上樣液處理的樣品在97.2 kDa存在蛋白條帶，推測可能由于β-巰基乙醇處理后蛋白質二硫鍵被打開，生成了新的結構。但醇溶性蛋白在泳道中顏色淺，說明其含量所占比例較小；堿溶性蛋白的分子量分布比較分散，此結果與鄭惠娜等[22]研究結果類似。經β-巰基乙醇處理后堿溶性蛋白在200.0、44.3與20.1 kDa處有明顯的蛋白條帶，而不經β-巰基乙醇處理后堿溶性蛋白在97.2和200.0 kDa處有明顯的蛋白條帶。

3 結論

本研究采用等電點沉淀法對牡蠣蛋白提取條件進行了優化，并系統地探索了牡蠣各蛋白組分及其分布特性。在室溫、溶解pH 12.0、提取時間1 h、酸沉pH 4.0條件下提取牡蠣蛋白，得到牡蠣蛋白純度高達84.3%，且該牡蠣蛋白中鹽溶性蛋白含量最高，為18.5%，水溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白含量分別為8.8%、1.4%和10.5%。對牡蠣蛋白各組分分子量分布進行分析后發現，牡蠣蛋白中鹽溶性蛋白和水溶性蛋白種類豐富，且各組分經β-巰基乙醇處理后出現新的條帶，這可能是由于蛋白質二硫鍵被打開，使亞基游離出來。值得注意的是在同類研究中發現與分子量分布在14.3 kDa蛋白條帶特征類似的條帶，推測可能是貝類特有的蛋白質，但該蛋白結構和功能尚不清楚，下一步將對其進行更深入地研究與討論。