茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性毒性試驗

張 濤，牛建功，劉 鴻，焦 飛，張人銘，蔡林鋼

(新疆維吾爾自治區水產科學研究所，農業部西北地區漁業資源環境科學觀測試驗站，新疆 烏魯木齊 830000)

扁吻魚(Aspiorhynchuslaticeps)又名新疆大頭魚，隸屬鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、扁吻魚幼魚屬。本屬全世界僅一種，為我國塔里木河水系的特有魚類[1]。扁吻魚已被列為國家一級保護水生動物[2]，在新疆被稱為“水中大熊貓”。其野外種群數量分布極少，1958—1965年，博斯騰湖扁吻魚幼魚年產140～260 t，但已基本絕跡，目前野外種群僅分布在渭干河克孜爾水庫[3]。

我國對魚類標記放流工作十分重視，2018年在新疆開展了扁吻魚幼魚首次標記放流工作，標記采用方法之一為熒光藥物(茜素紅S)浸泡法。茜素紅(Alizarin red，AR)是眾多染料中的一種，屬于蒽醌類化合物，被廣泛用于染料、酸堿指示劑，具有較高毒性、復雜結構以及化學需氧量(COD)值大等特點，是具有代表性的染料之一[4]。茜素紅S(ARS)是一種染料型配位劑，在分光光度分析方面已有了廣泛的應用。茜素紅S可以與鈣離子配合形成沉淀[5]，沉積在骨骼中，形成熒光標記[6]；茜素紅S相較于鹽酸四環素及茜素絡合指示劑更具價格優勢，適合大規模標記使用[7]。經染色的魚類耳石、鰭條及其他骨組織可以通過熒光顯微鏡發現明顯的熒光標記。同時，熒光藥物(茜素紅S)浸泡法，是一種操作簡單、對魚體傷害小的標記方法，但過高濃度引起致死率高；因此，篩選出適宜的茜素紅S標記濃度，對扁吻魚幼魚的標記工作具有重要的指導意義。熒光藥物浸泡法標記魚類使用廣泛，目前，國內對熒光藥物浸泡稀有魚句鯽、彭澤鯽[8]、鳡魚[9]、胭脂魚[10]、重口裂腹魚[11]等已有相關研究；常用水產藥物對扁吻魚幼魚的急性毒性也已見刊[12]，但至今關于扁吻魚幼魚標記放流工作中熒光藥物浸泡的急性毒性相關研究尚處于空白。通過設置不同濃度梯度的茜素紅S溶液，準確掌握藥物對扁吻魚幼魚的毒性影響，旨在為扁吻魚幼魚增殖放流中的大規模標記工作提供理論依據及數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料魚取自新疆阿克蘇地區扁吻魚幼魚原種場，運輸至克孜爾水庫管理局養殖車間暫養，7 d后挑選體表無傷、游動迅速、個體差異不大的扁吻魚幼魚用于試驗。隨機抽樣25尾測得扁吻魚幼魚體長范圍為(8.7±0.2)cm，體重范圍為(5.8±0.6)g。試驗期間所用養殖容器為長50 cm×寬30 cm×高30 cm的玻璃水族箱，試驗前用高錳酸鉀溶液進行消毒，每個容器盛水25 L，水溫10℃。200 W氧氣泵及材料一套，用于試驗期間養殖箱中水體的增氧。

1.2 試驗藥品

試驗所用的茜素紅S(NA)(C14H7NaO7S)為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，分子量342.26，生產批號：1002637274。前期先配制成1 g/L的母液，以備后期試驗使用。

1.3 試驗方法

參照霍來江[13]的研究結果，為確定茜素紅S濃度的大致范圍，設定預試驗茜素紅S濃度梯度為100、200、400、800、1 000 mg/L共5個濃度組，每個濃度組放16尾扁吻魚幼魚，24 h后觀察幼魚狀態，確定無死亡效應的茜素紅S最大濃度及100%致死濃度。正式試驗在無死亡效應的茜素紅S最大濃度和100%致死濃度之間按照等差數列設置試驗濃度梯度組和1個空白對照組，茜素紅S濃度分別為0、400、500、600、700、800、900 mg/L。設置3組平行試驗組，每個濃度試驗箱放入16尾扁吻魚幼魚，在試驗中，每隔4 h觀察幼魚狀況，將死亡的扁吻魚幼魚撈出并記錄數量及死亡時間。

1.4 試驗數據統計及分析

試驗結果統計采用平均值±標準差(Mean±SD)。

半致死質量濃度 LC50按寇氏法 (Karder)[14]求出：

Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

式中,Xm為死亡組最大劑量的對數；d為相鄰組濃度對數差；p為各組的死亡率；∑p為各組死亡率的總和。

將茜素紅S的濃度轉換為濃度對數，作為橫坐標；致死率作為縱坐標，用Excel 2007軟件進行統計分析，擬合回歸直線方程。

安全濃度SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

式中，SC為安全質量濃度；24 h LC50和 48 h LC50分別為24 h和48 h半致死質量濃度。

2 結果與分析

2.1 扁吻魚幼魚的中毒癥狀

茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性中毒表現為魚體游動出現異常，初期不時地劇烈游動、身體平衡性降低，鰓蓋活動頻次加快；后期扁吻魚幼魚游動緩慢，原地打轉，體表及各鰭條沾染紅色絮狀物，呼吸減緩，直至喪失游動能力，沉至養殖箱底部。觀察死亡的扁吻魚幼魚可發現各鰭條染色較重，口部微張，肛門處紅腫；解剖發現死亡個體肝臟腫大且顏色發黑，腸道出現潰爛，鰓絲發暗且黏連有紅色絮狀物。

2.2 茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性毒性

不同濃度的茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性毒性不同，隨著濃度的升高，扁吻魚幼魚的死亡率升高(表1)。在低濃度組400 mg/L時，扁吻魚幼魚未出現死亡，當茜素紅S濃度為500 mg/L，72 h出現首次死亡；在中濃度組600 mg/L時，在44 h出現首次死亡，96 h死亡率為43.75%，當茜素紅S濃度為700 mg/L時，首次死亡發生在24 h，死亡率為12.50%，96 h時全部死亡；在高濃度組800 mg/L時，扁吻魚幼魚首次死亡發生在20 h，48 h死亡率為81.25%，72 h時全部死亡，當茜素紅S濃度為900 mg/L時，首次死亡發生在8 h，24 h時死亡率100%。

表1 茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性毒性結果

注：“—”代表該處理組全部死亡。

Note：“—”denoted all of juveniles were dead.

表2 茜素紅S對扁吻魚幼魚的半致死濃度和安全濃度

注：y為死亡率概率單位，x為濃度對數。

Notes：ywas probit of mortality，xwas logarithm of copper ion concentration.

茜素紅S質量濃度對扁吻魚幼魚死亡率的線性方程如圖1所示，通過寇氏法公式計算出24 h的LC50值為788 mg/L，48 h的LC50值為718 mg/L，72 h的LC50值為651 mg/L，96 h的LC50值為618 mg/L。代入公式SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2，求出茜素紅S對扁吻魚幼魚的安全濃度(SC)為179 mg/L(表2)。

3 討論

急性毒性試驗是指在24 h內動物接受藥物1～2次(間歇時間為6～8 h)，動物所表現出的毒性反應。研究茜素紅S對扁吻魚幼魚的急性毒性，能夠為今后扁吻魚幼魚大規模藥物浸泡熒光標記放流提供數據參考。

大量試驗證實，魚類的致死率與熒光標記藥物濃度的升高呈現正相關性。歐陽斌等[8]在熒光物質浸泡標記稀有魚句鯽和彭澤鯽仔、稚魚的研究中發現，茜素絡合物在濃度為30～150 mg/L(浸泡24 h)時，稀有魚句鯽和彭澤鯽幼魚成活率大多達到100%；在濃度為200 mg/L時，死亡率為100%。付自東等[10]在胭脂魚熒光藥物浸泡試驗中，發現茜素絡合物在濃度為50～200 mg/L(浸泡24 h)時，幼魚無死亡；在濃度為250 mg/L時，幼魚死亡率為90%。何春林等[11]在研究重口裂腹魚時，發現茜素絡合物濃度≤350 mg/L時(浸泡12 h)，幼魚無死亡；當濃度≥400 mg/L(浸泡12 h)，幼魚全部死亡。梁小雙等[5]在研究紅鰭笛鯛標記技術時，發現茜素紅S濃度為100 mg/L時(浸泡36 h)，紅鰭笛鯛無死亡；在濃度為600 mg/L時，紅鰭笛鯛全部死亡。本試驗數據表明，扁吻魚幼魚在茜素紅S濃度為400 mg/L時(浸泡96 h)，幼魚無死亡；在濃度為700 mg/L時，全部死亡；印證了高濃度的熒光標記藥物會導致魚類較高的致死率。

試驗結果表明，茜素紅S對扁吻魚幼魚的安全質量濃度為179 mg/L，要高于中華倒刺鲃幼魚[13]的59.56 mg/L。根據危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法的等級評價標準，將96 h LC50分為4級 ：96 h LC50>10.0 mg/L為低毒；1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L為中毒；0.1 mg/L<96 h LC50≤1.0 mg/L為高毒；96 h LC50<0.1 mg/L為劇毒[15]。茜素紅S的96 h LC50為179 mg/L，故判定茜素紅S對扁吻魚幼魚為低毒性藥物，從藥物毒性考慮，該熒光藥物適合扁吻魚幼魚的標記。從扁吻魚幼魚的中毒癥狀可知，高濃度茜素紅S對魚的體表及鰓部均有較嚴重損傷；解剖發現其對肝膽傷害較大，故濃度過高會損害扁吻魚幼魚的體表黏膜及肝臟功能。茜素紅S濃度為400 mg/L時，96 h未出現死亡，因此在茜素紅S浸泡標記扁吻魚幼魚時，建議濃度設置在179～400 mg/L之間，以確保標記時用藥的安全性和有效性，同時取得較好的標記效果；下一步的工作應研究恰當的標記濃度及浸泡時間，了解不同浸泡時間下的標記效果及標記色的保留時間，以期最終指導扁吻魚幼魚人工增殖放流中的熒光藥物標記工作。