高效液相色譜測定咯菌腈在葡萄和土壤中的殘留行為

孫明娜，汪楚依，王 梅，董 旭，童 舟，褚 玥，高同春*，段勁生*

(1.安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(合肥)，安徽 合肥230031；2.安徽農業大學植物保護學院，安徽 合肥230036)

咯菌腈(fludioxonil)，商品名為適樂時(Celeste025FS)，化學名稱為4-(2.2-二氟-1.3-苯并二氧雜環戊烯-4-基)吡咯-3-腈[1]，是由先正達公司開發的的新型非內吸型苯基吡咯類廣譜殺菌劑，它高效、安全，既可用作葉面殺菌劑，用于防治雪腐鐮孢菌、小麥網腥黑腐菌、立枯病菌等，對灰霉病有特效；也可用作種子處理劑，主要用于防治谷物和非谷物類作物中的種傳和土傳病菌[2]。它兼具殺菌和抑菌作用[3]，其作用機理是通過抑制與葡萄糖磷酰化有關的轉運來抑制菌絲生長，最終導致病菌的死亡[4]。它用于種子處理，可防治種子帶菌及土壤傳播的真菌病害。其作用機理獨特，持效期長，且不與其他殺菌劑發生交互抗性，屬觸殺型殺菌劑[5]。

葡萄病蟲害的防治主要以化學防治為主，但在實際的生產中，由于有些性質穩定、不易分解的農藥品種，或者不科學的使用農藥就會造成過高的農藥殘留量[6]，對非靶標生物造成健康危害，從而威脅到人類的身體健康和生存環境[7]。近幾年來，高效農藥品種不斷出現，農藥在農產品和環境中的殘留非常低，就促使我們發展更加有針對性的檢測方法[8]，查閱現有文獻，目前國內外對于咯菌腈的主要檢測方法是應用氣相色譜法(GC)[9]、氣相色譜質譜法(GC-MS)[10]、也有研究報道使用高效液相色譜法(HPLC)[11]進行檢測分析的，但是到目前為止，國內單獨對咯菌腈在葡萄上的殘留分析報道很少，國外大多是復配后的分析報道，大多是在其它基質上的分析。本試驗建立了咯菌腈在葡萄和土壤中的殘留檢測的高效液相色譜方法，以期為葡萄中咯菌腈的殘留檢測提供技術參考[12]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 咯菌腈標準品純度99.4%(購自自上海市農藥研究所有限公司)；CNW弗羅里硅土SPE小柱，500mg/6mL；PSA粒徑40～60um；C18粒徑50um；乙腈、二氯甲烷、氯化鈉、均為分析純；甲醇為色譜純。

安捷倫1200高效液相色譜儀；RotavaporR-100型旋轉蒸發儀，瑞士步琪公司；N-EVAP24氮吹儀，美國Organomation儀器有限公司；高速萬能粉碎機，北京市永光明醫療儀器有限公司；ZB-85氣浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市中大儀器廠；FA2104S電子天平，上海天平儀器廠。

1.2 田間試驗方法 實驗于2016～2017年在蕭縣和辛集兩地露天實驗地進行，供試藥劑為40%咯菌腈懸浮劑，供試葡萄品種在安徽蕭縣為巨玫瑰，在河北辛集為巨峰。

1.2.1 消解動態試驗 葡萄消解動態：設3個重復小區，每小區面積30m2，至少有30穗以上葡萄。于果實成熟一半大時(盛花后約35d左右)施藥1次，并做標記，施藥劑量200mg a.i/kg(制劑2 000倍液)。于施藥后2h和1、3、5、7、14、21、30d用隨機方法在試驗小區內不同位置及上下不同部位采集6～12串(2kg以上)施藥時確已著藥、生長正常、無病害的葡萄果實。

土壤消解動態：選一30m2空白平整無植被土地，以200mg a.i/kg(制劑2 000倍液)的施藥濃度，按照當地一畝葡萄園噴藥的用水量換算出30m2土壤的用藥量和兌水量，進行均勻噴霧，土壤樣品每小區采集12點，消解動態試驗取土深度0～10cm，采樣量≥1kg。

1.2.2 最終殘留試驗 設2個施藥劑量，分別為低劑量133.3mg a.i/kg(制劑3 000倍液)和高劑量200mg a.i/kg(制劑2 000倍液)，于葡萄灰霉病發生初期田間噴霧，施藥次數分別為3、4次，施藥間隔期7d，每個處理設3個重復小區，每小區面積為30m2，小區之間設保護行，按照劑量由低到高的順序，施藥時應保持均速，使藥液盡可能均勻地分布，不需要專門噴施土壤，并對著藥果實采用系繩等方法進行標記，于最后1次施藥后5、7、14d，采集成熟葡萄果實和土壤(0～15cm)樣品。

1.2.3 葡萄果實和土壤的取樣和處理 葡萄樣品：將葡萄田間樣本棄去病萄地表面。于施藥后2h和1、3、5、7、14、21、30、45d采粒、殘粒，除去果梗,混合均勻后，分取150g樣品2份，按要求裝入封口樣品容器中，并按規定內容貼好標簽。

土壤樣品：過1mm孔徑分樣篩，混勻土樣，四分法留取約150g樣品2份。

所有樣品均與-20℃下保存，備用。

1.3 分析步驟

1.3.1 葡萄樣品前處理 稱取20.0g打碎的葡萄樣品于50mL離心管中，加入30mL二氯甲烷，機械振蕩60min后靜置5min，取15mL下層提取液濃縮近干，氮氣吹干后加5mL甲醇/二氯甲烷(10∶90)溶解待凈化。用5mL甲醇預淋弗羅里硅土小柱棄去，轉移溶解液上柱，并用5mL×3甲醇:二氯甲烷(10∶90,V∶V)溶液洗脫，合并淋洗液15mL，濃縮近干，氮氣吹干后用甲醇定容至5mL，過0.22μm濾膜液相待測。

1.3.2 土壤樣品前處理 稱取20.0g土壤樣品于50mL離心管中，加入30mL乙腈(含0.1%甲酸)，機械振蕩60min，加入3g氯化鈉，劇烈振蕩1min后5 000r/min離心5min。取15mL上清液濃縮近干，氮氣吹干后用5mL甲醇定容，移入裝有75mgC18、75mgPSA的微型離心管中，渦旋1min后5 000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾膜待液相檢測。

1.4 分析測定 檢測條件：安捷倫1200HPLC(紫外檢測器)，流動相為乙腈：水=55∶45(V∶V)，色譜柱:4.6mm×250mm，AgilentHC-C18柱；檢測波長：260nm；流速：0.8mL/min；柱溫：40℃；進樣量10μL。

1.5 標準溶液的配置和標準曲線的繪制 準確稱取咯菌腈標準品，用甲醇溶解并配置成1 000mg/L的標準儲備液，將1 000mg/L咯菌腈標準溶液用甲醇稀釋配得10、5、1、0.5、0.1、0.05mg/L系列標準溶液，在上述液相色譜條件下進行測定，其中y為咯菌腈峰面積，x為標準溶液濃度，以咯菌腈標準溶液濃度和測得的相應峰面積制作標準曲線。

1.6 添加回收試驗 取未施用過咯菌腈的葡萄和土壤20.0g，進行添加回收試驗，添加水平為0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/L，每檔重復5次。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍、回收率、精密度及檢出限 結果表明：在0.05～10mg/L范圍內，咯菌腈標準溶液濃度和測得的相應峰面積呈良好的線性關系，其標準線性方程為y=30.951x-0.417 1，相關系數為0.999 8。在0.02～2.0mg/kg添加水平下，咯菌腈在葡萄和土壤中的平均回收率分別為：89.0%～95.8%和88.2%～90.5%，相對標準偏差分別為：1.1%～7.1%和0.8%～6.4%。(表1和圖1)咯菌腈在葡萄和土壤中的最小檢出量為5×10-10g，最低檢測濃度為0.02mg/kg，符合殘留分析檢測要求。

表1 咯菌腈在葡萄和土壤上的平均添加回收率和相對標準偏差

2.2 色譜條件的優化 由于咯菌腈標準溶液在260nm處有最大收峰，故選擇260nm作為檢測波長(圖2)。分別以乙腈-水、甲醇-水不同比例作為流動相，綜合考慮咯菌腈的保留時間及峰型，最終確定以V(乙腈)∶V(水)=55∶45，流速為0.8mL/min，柱溫：40℃。咯菌腈標準溶液色譜圖(圖3)。在此檢測條件下，儀器對咯菌腈的最小最小檢出量為5×10-10g。

2.3 提取劑選擇和提取條件的優化 根據咯菌腈的極性與溶解性，分別選用了二氯甲烷、乙腈、乙腈(1%甲酸)、石油醚、正己烷、乙酸乙酯為提取劑，同時分別采取超聲、機械振蕩等提取方式對比提取效果。結果表明：葡萄和土壤對不同提取劑的提取效果區別很大，其中石油醚、正己烷、乙酸乙酯在葡萄和土壤中的添加回收率均較低，而二氯甲烷、乙腈、乙腈(1%甲酸)在葡萄中的添加回收率分別為99.8%、89.5%和98.4%，在土壤中的添加回收率分別為85.0%、101.4%和99.2%。葡萄的提取劑在使用乙腈(1%甲酸)時，目標化合物相對保留時間處有雜峰干擾，經過對比最終選擇二氯甲烷作為葡萄的提取劑，而乙腈和乙腈(1%甲酸)對土壤提取效果相差不大，而使用乙腈作為提取劑成本較低也相對環保，最終選擇乙腈作為土壤的提取劑(表2)。此外，本試驗還對超聲提取和機械振蕩2種提取方式進行了比較。結果發現(表3)，機械振蕩的提取效率最高，咯菌腈在葡萄和土壤中的平均回收率分別為87.4%和92.3%，明顯優于超聲提取的平均回收率67.1%和71.9%，故采用機械振蕩作為葡萄和土壤提取方式。

a:葡萄空白(Blankgrape)b：葡萄添加(Grape)(0.2mg/kg) c:土壤空白(Blanksoil)d：土壤添加(Soil)(0.2mg/kg)圖1 葡萄和土壤空白樣品及添加回收色譜

圖2 咯菌腈標準液檢測波長

圖3 咯菌腈標準溶液色譜圖(1mg/L)

提取劑平均回收率±標準偏差(%)相對標準偏差RSD(%)葡萄土壤葡萄土壤30mL二氯甲烷99.8±0.885.0±2.20.81.830mL乙腈89.5±0.8101.4±0.50.70.530mL乙腈(1%甲酸)98.4±0.799.2±1.00.70.930mL乙酸乙酯50.6±0.960.2±2.00.51.230mL正己烷59.0±0.823.5±0.50.50.130mL石油醚50.8±0.333.7±0.70.20.2

表3 不同提取方式提取葡萄和土壤中咯菌腈的回收率

2.4 咯菌腈在葡萄上的消解動態 安徽蕭縣和河北辛集兩年兩地的消解試驗結果顯示：施藥2h后，咯菌腈在2016年安徽蕭縣和河北辛集葡萄上的的原始沉積量分別為：0.870、0.064mg/kg；在2017年安徽蕭縣和河北辛集葡萄上的原始沉積量分別為：2.327、1.160mg/kg。40%咯菌腈懸浮液在安徽蕭縣葡萄上的消解方程分別為：y=0.840 3e-0.092x(2016)、y=0.999 9e-0.124x(2017)；在河北辛集葡萄上的消解方程分別為：y=0.056 2e-0.089x(2016)、y=0.994 2e-0.087x(2017)；半衰期分別為5.6～7.5d(2016～2017，安徽蕭縣)、7.8～8.0d(2016～2017，河北辛集)。咯菌腈在葡萄中的殘留量隨著時間的延長逐漸降低，且施藥21d后，其殘留量均降解85%以上。

2.5 咯菌腈在土壤上的消解動態 40%咯菌腈懸浮液在土壤中的消解動態結果顯示：施藥2h后，咯菌腈在2016年安徽蕭縣和河北辛集土壤上的的原始沉積量分別為：0.070、0.032mg/kg；在2017年安徽蕭縣和河北辛集土壤上的的原始沉積量分別為：1.019 6、0.228 6mg/kg。40%咯菌腈懸浮液在安徽蕭縣土壤上的消解方程分別為：y=0.054 3e-0.109x(2016)、y=0.388 4e-0.071x(2017)；在河北辛集土壤上的消解方程分別為：y=0.030 9e-0.085x(2016)、y=0.202 7e-0.115x(2017)；施藥14d后，消解率在90%以上，安徽蕭縣土壤的半衰期為6.3～9.8d，河北辛集土壤的半衰期為6.0～8.1d。

2.6 咯菌腈在葡萄中和土壤中的最終殘留量 2016～2017年安徽蕭縣和河北辛集兩年兩地葡萄和土壤的最終殘留檢測結果(表4)表明：40%咯菌腈懸浮液以低劑量133.3mg a.i./kg(制劑3 000倍液)和高劑量200mg a.i./kg(制劑2 000倍液)分別施藥3、4次，咯菌腈的殘留量與施藥濃度、施藥次數基本上呈正相關，施藥濃度越高、次數越多，殘留量越高；咯菌腈的殘留量與采收間隔期呈負相關，采收時間距最后1次施藥時間越長，殘留量越低。

表4 2016～2017年安徽和河北葡萄和土壤中咯菌腈的最終殘留量

3 結論

本研究建立了咯菌腈在葡萄和土壤中殘留量的前處理和高效液相色譜上的檢測方法，并進行了40%咯菌腈懸浮液在葡萄和土壤中的消解動態和最終殘留試驗。消解動態結果表明：咯菌腈在葡萄和土壤中的半衰期分別為5.6～8.0d和6.0～9.8d，最終殘留量測定結果顯示40%咯菌腈懸浮劑，用于防治葡萄灰霉病，施藥劑量不超過133.3mg a.i./kg(制劑3 000倍液)，最多施藥3次，安全間隔期為7d。上述結果可為中國制定咯菌腈在葡萄上的MRL值提供參考。