蘋果組培外植體消毒及培養基優化試驗研究

龐 曼 李 娜 張 心 高玉倩 張蒙蒙 張彥坤

（1河北慕旭農業科技有限公司 河北 定州 073006；2河北省林業科學研究院 河北 石家莊 050061；3定州市科學技術局 河北 定州 073006）

蘋果屬于薔薇科，蘋果屬，是世界主要栽植果樹品種之一。落葉喬木，葉橢圓形，有鋸齒；果實球形，味甜，營養豐富；果肉清脆香甜，能幫助消化。我國蘋果的總產量和栽培面積均位居世界第一，但是蘋果品質差、單產低、總體生產水平比較落后，導致這種現狀的主要因素之一是蘋果病毒病的侵害。

目前應用在蘋果育苗上的脫毒方法有很多，但是應用比較廣泛的主要是莖尖培養、熱處理以及抗病毒劑方法。國內在種苗組培快繁、脫毒方面做了很多的研究工作，但只有少量品種進入工廠化生產階段，盡管組培苗的生產具有繁殖周期短、繁殖系數高、不受生長季節限制、生產種苗質量好、整齊度高、可脫去部分植物病毒等諸多優點，但也存在著一次性投資大、成本高、技術步驟繁雜、技術易傳性差、試管苗成活率低、推廣難度大等缺點。因而如何降低生產成本，簡化工藝，提高繁殖系數和成活率，達到規模化、商品化生產是組培技術研究的重要方向[1]。本試驗就組培過程中外植體消毒和培養基的優化以及接種方面進行了研究，為蘋果育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。幼苗：取自公司大棚內蘋果小苗。其他材料：MS培養基、蔗糖、瓊脂、6-BA、吲哚丁酸(IBA)、升汞(0.1%)、酒精(95%)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理。2016年4月中旬，從待脫毒蘋果苗上剪取接穗，采用切接法嫁接在盆栽實生砧苗上，嫁接成活后，按常規苗在室外進行管理。經過一年培育后，于第二年在定州市東亭鎮國家農業科技園區的智能溫室內繼續培養，于地面以上15 cm剪截留5個左右飽滿芽，待蘋果苗萌動長出幼葉后，進行熱處理脫毒，具體方法：將其移入恒溫熱處理箱，在30℃下處理2d后，每天升高1℃，當溫度升至36℃時，處理2 d，升至37℃時處理2 d，然后在38℃下恒溫處理30 d[2]。

1.2.2 外植體的獲取。在熱處理過程中長出的新梢頂端切取2～3cm的頂尖作為外植體，在低倍顯微鏡下剝離幼葉和葉原基，切取0.3～0.5mm的莖尖進行組織培養。

1.2.3 外植體消毒處理。使用75%酒精和0.1%升汞進行消毒，消毒時間分別為酒精10 s、15 s、20 s，升汞8 min、10 min。基礎培養基分別為MS+蔗糖30 g/L、2/3MS+蔗糖20 g/L、1/2MS+蔗糖15 g/L、1/3MS+蔗糖10 g/L，其他配比：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6 g/L瓊脂。

1.3 指標計算方法

污染率(%)=(真菌或者細菌污染的芽數/供試芽數)×100%

成活率(%)=(未死亡的芽數/未被污染的芽數)×100%

萌發率(%)=(轉綠的芽數/接種數)×100%

褐化率(%)=(產生褐化芽數/接種數)×100%

注：此處的接種數為不含污染的芽數

生長狀況描述：莖尖萎蔫、莖尖微黃、莖尖淡綠、莖尖濃綠。

2 結果與分析

2.1 酒精和升汞不同消毒時間對蘋果外植體的影響。從表1可以看出，升汞消毒10min時，成活率都不高，污染率為最低48%，但成活率只有30%，說明升汞對外植體的傷害比較大；酒精消毒15s時最為適宜，消毒時間過低表面殺菌不徹底，太高對外植體有傷害作用。綜合考慮，酒精消毒15s，升汞消毒8min最適宜。

表1 酒精和升汞不同消毒時間組合對蘋果外植體的影響

2.2 不同培養基對蘋果外植體誘導影響。從表2中可以看出，2/3MS培養基最有利于蘋果外植體的誘導，而且其生長狀態也是最好，但總體來說褐化現象還是比較嚴重。

表2 不同培養基對蘋果外植體誘導影響

2.3 接種次數對外植體褐化的影響。從表3可以看出，隨著接種次數的增加，外植體褐化率明顯下降，考慮成本因素，轉接培養基的次數為4時，可達到理想的效果。

表3 接種次數對外植體褐化的影響

3 結論和討論

在植物離體培養中，外植體消毒是組培的關鍵技術，常用的外植體消毒試劑比較多，主要有次氯酸鈉、過氧化氫、酒精、升汞等，次氯酸鈉的滅菌作用很強，易去除，但其堿性很強，對幼嫩植體的毒害作用大，不適宜作滅菌劑。過氧化氫其作用效果最好，對植物外植體的殺害也比較小，但其具有極強的毒性，使用后需回收。酒精對外植體的殺傷力大，作用時間應該嚴格控制。本試驗結果顯示，酒精作用時間15 s，升汞作用時間8 s為最適宜的蘋果外植體消毒組合。本試驗對莖尖不同培養基進行探討，結果表明，MS培養基中大量元素減去1/3后培養莖尖，褐化率顯著低于MS培養基。通過增加培養基轉接次數能夠明顯的降低褐化的程度，可能是增加接種次數使得殘留至培養基的代謝物比較少，是否這一原因還需進一步研究。而有研究證明了培養基中的無機鹽越低褐化程度越低，因為過高的無機鹽能夠促進細胞新陳代謝，從而使得細胞內產生的代謝物質增加，遇見氧氣后，氧化變褐[3]。

蘋果病毒病在全世界各地的分布較為廣泛，其危害也很嚴重，蘋果樹體受病毒侵害以后，產量會下降，品質也會受到影響，因此經濟效益也不高[4]。本試驗采用熱處理和莖尖組培相結合的方式進行脫毒培養，后期通過酶聯免疫結合PCR技術對瓶苗進行病毒檢測，結果顯示脫毒效果良好，可作為種苗繁殖。