甲狀腺素對(duì)大鼠海馬細(xì)胞凋亡和AMPA、NMDA受體的影響

謝奇?zhèn)?方紳哲 唐文昱 施晨潔 趙晶 韋登明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，浙江 寧波 315211)

甲狀腺功能亢進(jìn)癥(甲亢)是由于過多的甲狀腺激素釋放導(dǎo)致心臟、肌肉、大腦等多器官的損傷的疾病，其可導(dǎo)致機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶力減弱，但具體機(jī)制尚不清楚〔1〕。研究表明〔2～4〕，機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶的改變與海馬細(xì)胞的凋亡及谷氨酸受體〔α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)〕表達(dá)變化有關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外尚未見甲亢導(dǎo)致的機(jī)體學(xué)習(xí)記憶力降低是否與海馬細(xì)胞的凋亡及AMPA受體和NMDA受體表達(dá)變化有關(guān)的報(bào)道。本研究在建立甲亢大鼠模型基礎(chǔ)上，旨在研究甲狀腺素對(duì)大鼠海馬細(xì)胞凋亡和AMPA、NMDA受體的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 健康清潔級(jí)SD大鼠20只由寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)于浙江省動(dòng)物中心，合格證號(hào)0102016，體重(200±10)g，雄性。隨機(jī)分為對(duì)照組、甲亢組，每組各10只。兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體(博士德生物有限公司)；兔抗鼠AMPA、NMDA抗體(博士德生物有限公司)；L-甲狀腺素粉劑和羧甲基纖維素鈉(美國(guó)Sigma公司)；山羊抗兔Ⅱ抗(中杉金橋有限公司)。BM-Ⅶ包埋機(jī)(宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本Olympus公司)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)；RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)。

1.2動(dòng)物模型的建立 模型參照文獻(xiàn)方法〔5，6〕并進(jìn)行改良后建立。將L-甲狀腺素0.1 g/L混懸于5 g/L羧甲基纖維素鈉中，置于冰箱保存待用，使用前充分搖勻。甲亢組大鼠每天腹腔注射L-甲狀腺素0.5 mg/kg連續(xù)35 d，對(duì)照組腹腔注射等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。大鼠均喂常規(guī)固體飼料及瓶裝飲用水。

1.3標(biāo)本采用與制取 L-甲狀腺素腹腔注射給藥35 d，成功制備甲亢大鼠模型。將大鼠用水合氯醛麻醉后，開顱取含有海馬的腦組織塊置10%甲醛中，固定、脫水、浸蠟、包埋后制成石蠟切片。進(jìn)行 HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.4血清三碘甲腺原氨酸(T3)、血清總甲狀腺素(T4)含量的檢測(cè) 提取大鼠心血5 ml，用放射免疫分析法測(cè)定血清中T3、T4含量，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5Morris水迷宮檢測(cè) 采用Morris水迷宮試驗(yàn)〔7〕：(1)定位航行：連續(xù)5 d早晨將大鼠各從2個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記下大鼠在90 s內(nèi)游上平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期)，通過它來檢測(cè)其學(xué)習(xí)力；(2)空間探索：第6天拆除平臺(tái)，將其各從2個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠90 s時(shí)間內(nèi)在平臺(tái)所在象限的總共停留時(shí)間。

1.6免疫組化檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白、AMPA、NMDA受體的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟，在3%過氧化氫(H2O2)中室溫孵育，0.01 mmol/L枸櫞酸溶液高溫抗原修復(fù)，使用正常山羊血清封閉，滴加抗Bax(1∶50)、Bcl-2(1∶50)、AMPA(1∶400)、NMDA(1∶400)抗體免疫組化染色，置于濕盒中4℃冰箱環(huán)境過夜。滴加二抗，進(jìn)行鏈霉親和素-生物復(fù)合物(SABC)反應(yīng)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。蘇木素復(fù)染脫水透明封片。在400倍光鏡下，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)〔8〕，分別計(jì)算Bax、Bcl-2和AMPA、NMDA受體平均積分光密度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清T3、T4水平比較 與對(duì)照組比較，甲亢組血清T3、T4水平明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 兩組血清T3、T4水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；表3同

2.2兩組逃避潛伏期比較 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠的平臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.05)。與對(duì)照組比較，第3～5天甲亢組逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 兩組逃避潛伏期

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；組內(nèi)與前一時(shí)間點(diǎn)比較：2)P<0.05

2.3兩組海馬Bax、Bcl-2、AMPA、NMDA受體的表達(dá) 與對(duì)照組比較，甲亢組海馬Bax蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)；Bcl-2蛋白及AMPA受體和NMDA受體的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見表3、圖1。

表3 兩組Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受體表達(dá)

圖1 海馬Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受體的表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討 論

Bcl-2家族是細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控常用的凋亡表達(dá)基因，包括Bcl-2基因和Bax基因。研究表明〔9～12〕，Bax、Bcl-2 蛋白的表達(dá)和兩者之間的比例關(guān)系是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。Bcl-2蛋白可以通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度、降低細(xì)胞膜通透性、減少細(xì)胞色素C的釋放，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。而Bax 基因?qū)cl-2 具有拮抗作用，它編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體。本研究結(jié)果表明，甲亢大鼠在學(xué)習(xí)記憶方面有明顯的減弱；長(zhǎng)期高濃度的甲狀腺素可能通過增加Bax蛋白的表達(dá)，減少Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致記憶力降低。

研究表明〔12～15〕，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制是海馬正常工作的基礎(chǔ)。它依賴于AMPA受體和NMDA受體的表達(dá)。高頻刺激使突觸前膜釋放的谷氨酸遞質(zhì)，與突觸后膜上的AMPA受體結(jié)合使突觸后膜去極化。突觸后膜去極化達(dá)到一定程度后，NMDA受體通道內(nèi)的Mg2+移開，使 Ca2+內(nèi)流，觸發(fā)一系列生化反應(yīng)，導(dǎo)致LTP的產(chǎn)生。本研究結(jié)果提示長(zhǎng)期高濃度的甲狀腺素可能通過減少AMPA受體和NMDA受體的表達(dá)從而導(dǎo)致記憶力降低。