益腎調督法電針對β-淀粉樣蛋白1～42誘導的阿爾茨海默病大鼠血清和腦內炎性因子的調節作用

王蕓 陶一鳴 孫國杰 肖佳歡 杜艷軍，2

(1湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，湖北 武漢 430061；2湖北省針灸治未病協同創新中心)

阿爾茨海默病(AD)屬于一種原發性大腦退行性疾病，隱匿性是其起病特點，以進行性認知功能障礙和行為學改變為主要臨床表現。本病的發病機制十分復雜，淀粉樣蛋白假說、tau蛋白假說、炎癥和免疫假說、膽堿能功能低下假說、基因突變假說、氧化應激和興奮性毒性假說等都是目前較為被接受的學說〔1〕。AD病位在腦，腎虛髓減、神機失用是AD發生的根本病機，結合AD發病年齡特點，腎虛尤被重視。本研究基于前期研究〔2，3〕，旨在探討益腎調督法電針對β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42誘導的AD模型大鼠血清、不同腦區內的不同經典炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與試劑 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀；牙科鉆；微量注射器；華佗牌Φ0.30×25.00 mm不銹鋼毫針；G6805-Ⅱ型電針治療儀；高速冷凍離心機；顯微鏡(Olympus，Japan)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α一抗(ab6671)、干擾素(IFN)-γ一抗(ab133566)、白細胞介素(IL)-1β一抗(sc7884)、IL-4一抗(sc53084)、IL-10一抗(ab9969)、轉化生長因子(TGF)-β1一抗(ab66043)；10%水合氯醛、4%多聚甲醛等。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物及分組 40只SPF級雄性Wistar大鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)，8月齡，體重(380±20)g。適應性喂養在溫度(22±2)℃的動物室，自然光線，自由飲水，普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。隨機分為對照組、假手術組、模型組和治療組各10只。

1.2.2動物模型的復制 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，于腦立體定位儀上呈俯臥固定，保持前后囟同一水平。剪開頭皮暴露前囟，按照大鼠腦立體定位圖譜〔4〕定位海馬區域(前囟后3.3 mm，中線左右各旁開1.5 mm，深度3 mm)，微量注射器緩慢注入5 μl聚集肽的 Aβ1～42(制備法：0.1 mg Aβ1～42單體，二甲基亞砜50 μl溶解，離心，加入50 μl 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，稀釋配制成1 μg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育7 d)，5 min內注射完，靜置3 min，緩慢出針(速度1.0 mm/min)，防止藥物溢出，牙托粉封固，縫合皮膚，造模完成。肌注青霉素G 10萬U，連續3 d。

1.2.3干預方法 治療組于模型復制成功后，參考《實驗針灸學》動物穴位圖譜選取百會(GV20，頂骨正中)和腎俞(BL23，第2腰椎下兩旁)穴〔5〕，采用0.30 mm×25.00 mm不銹鋼針灸針，百會向前平刺3～5 mm，腎俞穴稍向內斜刺5 mm，接 G6805-Ⅱ型治療儀(雙側腎俞穴交替選擇)，連續波，頻率5 Hz，強度以后爪輕微抖動為度。1次/d，20 min/次，每療程連續6 d，療程間間隔1 d，共2個療程。對照組與模型組不予電針刺激。假手術組僅在造模過程中注射等量生理鹽水，余步驟同模型組。

1.2.4動物取材 經10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，行胸腹聯合切口，先暴露腹主動脈，采血針管取血，離心取上清液。再切斷肋骨、膈肌，心臟暴露時從左心室插入灌注針頭，并快速灌入無菌生理鹽水，同時剪開右心耳，沖洗血液至肝臟發白。繼改用4%多聚甲醛灌注固定至軀干四肢僵硬狀。斷頭取腦，視交叉平面后4 mm冠狀切腦，置于4%多聚甲醛外固定24 h。

1.2.5檢測方法 ELISA嚴格按照試劑盒說明書操作。加入100 μl稀釋的樣品于已包被之反應孔中；溫育1～2 h；洗滌后，將稀釋好的100 μl生物素化抗體工作液加入各孔中；溫育1 h；洗滌；已稀釋的100 μl酶結合物工作液加入各孔中；溫育30 min；將100 μl四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液加入各孔中顯色，37℃，避光反應10～30 min；將100 μl 2 mol/L硫酸加入反應孔中終止反應，顏色由藍變黃的10 min之內，450 nm酶標下調零空白對照孔，繼測各孔OD值。根據標準品的濃度和OD值做出標準曲線，計算出樣本的濃度。免疫組化法，常規石蠟切片脫蠟至水；乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液抗原修復；37℃，用3%H2O2孵育25 min，置磷酸鹽緩沖液(PBS)中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，適當滴入3%牛血清蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，封閉30 min；一抗4℃孵育過夜，后置PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，加入二抗，孵育50 min，再置于PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗終止反應；蘇木精復染、脫水、透明、封片。用顯微鏡采集圖像，每組隨機選取10張400倍視野下圖片，圖片應讓組織填滿整個視野。應用 Image-Pro Plus6.0軟件分析，記錄每張圖片陽性累積光密度值(IOD值)和面積(Area)，用 IOD/Area求得平均光密度值(MOD)。數值越大表示含量越多，指標陽性表達越強，數值越小表示陽性表達越弱。

1.3統計分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1電針對各組血清不同炎性因子的影響 模型組血清TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平明顯高于假手術組和對照組(均P<0.01)，IL-4、IL-10、TGF-β1水平明顯低于假手術組和對照組(均P<0.01)。與模型組比較，治療組血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平顯著下調，IL-4、IL-10、TGF-β1水平顯著上調(均P<0.01)，提示電針百會、腎俞穴能夠下調AD大鼠血清促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β的濃度，并上調AD大鼠血清抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1的濃度，對血清炎性反應的持續性發生具有抑制作用。見表1。

2.2電針對各組腦內不同炎性因子的影響 模型組海馬區TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的 MOD值均明顯高于對照組和假手術組(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10和 TGF-β1的MOD值明顯低于對照組和假手術組(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，治療組下調海馬區TNF-α、 IFN-γ和IL-1β和上調海馬區IL-4、IL-10和TGF-β1的MOD值(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 各組血清促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1水平的比較

與對照組和假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

表2 各組海馬區促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1的MOD值比較

與對照組和假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各組腦內不同部位免疫組化染色情況 由圖1可見，對照組大鼠皮質、海馬區的神經細胞大小均一、齒狀回區細胞排列致密，未見TNF-α深染；假手術組在皮質區可見少量棕褐色陽性表達，其他部位TNF-α陽性表達尚不明顯；模型組皮質、海馬、齒狀回均可見大量棕褐色陽性表達，海馬區神經細胞層次較紊亂，有細胞核固縮，且附近膠質細胞有輕度增生現象；而治療組皮質、海馬和齒狀回細胞TNF-α抗體染色則明顯減弱。由圖2可見，在對照組與假手術組的海馬齒狀回，可見到呈棕褐色的陽性表達。由圖可見，IFN-γ主要表達于海馬部神經元和膠質細胞的胞質。模型組同對照組比較，陽性胞質數量上較多，染色偏濃；治療組同模型組比較，陽性表達胞質較少，且染色偏淡。由圖3可見，對照組、假手術組大鼠皮質、海馬、齒狀回神經細胞大小均一、排列較整齊；AD大鼠皮質及海馬區神經細胞明顯棕色陽性表達，細胞排列較紊亂；IL-1β棕褐色陽性表達在治療組皮質、海馬區明顯減弱。由圖4可見，對照組皮質、海馬區神經細胞形態清晰，層次緊密，大量神經細胞呈棕褐色深染；模型組皮質及海馬神經細胞IL-4棕褐色陽性表達明顯減少；治療組皮質神經細胞染色明顯增強。由圖5可見，在對照組與假手術組大鼠海馬齒狀回，神經細胞胞核和胞質均可見到呈棕褐色的陽性表達，且細胞核的密度較高，數目較多，輪廓較清晰。模型組同對照組比較，細胞排列稀疏，IL-10染色偏淡；治療組同模型組比較，陽性表達細胞增多，且IL-10染色偏濃。由圖6可見，對照組皮質、海馬、齒狀回大量神經細胞呈棕褐色深染；假手術組皮質、海馬、齒狀回神經細胞棕褐色陽性表達雖不如對照組明顯，但仍可見到均勻分布的棕褐色細胞；模型組各區TGF-β1陽性表達明顯減少；治療組較模型組神經細胞染色顯著加深，數量增多。

A：對照組；B：假手術組；C：模型組；D：治療組；下圖同圖1 各組腦組織TNF-α免疫組化法染色(×400)

圖2 各組腦組織IFN-γ免疫組化法染色(×400)

圖3 各組腦組織IL-1β免疫組化法染色(×400)

圖4 各組腦組織IL-4免疫組化法染色(×400)

圖5 各組腦組織IL-10免疫組化法染色(×400)

圖6 各組腦組織TGF-β1免疫組化法染色(×400)

3 討 論

AD病理特征主要為神經元外的Aβ聚集形成老年斑，神經元內tau蛋白異常聚集形成神經原纖維纏結，腦皮質及海馬膽堿能神經元及其突觸大量丟失，累及的皮質動脈出現血管淀粉樣變性〔6〕。目前大腦的持續性炎性反應已被公認為AD的重要病理表現〔7，8〕，研究也表明炎性反應在AD發生發展過程中起重要作用〔9，10〕。

細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他因子刺激細胞所產生的低分子質量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫應答，促進造血、刺激細胞活化、增殖和分化等功能〔11〕。細胞因子按照對機體的效應可分為促炎因子和抗炎因子兩大類。在促炎因子中，TNF-α是具有廣泛生物學效應的細胞因子，可以誘導其他前炎性細胞因子及炎性相關蛋白表達，IL-1β是炎癥免疫反應初始調控因子，以誘發炎性反應及機體防御反應為主。Aβ可持續激活小膠質細胞，并過量表達炎癥因子TNF-α、IL-1β等，TNF-α反饋性刺激小膠質細胞和星形膠質細胞分泌更多的炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IFN-γ，在促成與放大炎性級聯反應的過程中，AD 患者腦中不可避免形成慢性炎性效應〔12〕。 研究發現單獨的TNF-α不影響淀粉樣前體蛋白(APP)的產生和代謝，但IFN-γ可誘導APP的轉錄和翻譯，使APP 釋放增多；TNF-α對小膠質細胞Aβ1～42 趨化受體表達的上調作用加劇了Aβ過度生成，從而加速AD病理進程。臨床上發現 AD患者血液和腦脊液中IL-1β和TNF-α水平升高〔6，13〕，已不懷疑IL-1β和 TNF-α可能為介導AD炎癥病理反應的關鍵因子， 本實驗也得出了一致的結果。IFN-γ主要來源于T淋巴細胞，是一個促炎性細胞因子，在中樞神經系統疾病中，IFN-γ除已知的促炎和破壞效果也是一個保護性和調節性的細胞因子〔14〕。臨床研究發現〔15〕AD患者隨著病情的加重，血清IFN-γ水平存在逐漸增高的趨勢。同樣有實驗觀察到AD大鼠腦內IFN-γ表達明顯增加〔16〕。

在抗炎因子中IL-4、IL-10是膠質細胞分泌的主要免疫抑制性細胞因子。Aβ1～42刺激會引起腦免疫細胞釋放IL-4，后者能為神經干細胞提供危險信號〔17〕，而 IL-10在維持神經元穩態和能量代謝平衡、細胞存活等方面發揮重要作用〔18〕。已知AD患者血清和腦脊液中炎性因子水平與病情嚴重程度相關，其中IL-10尤其與Aβ42、Aβ42/p-tau比值呈明顯負相關〔19，20〕，提示血清IL-10水平可作為判斷腦內Aβ沉積的標志物。也說明AD不是單純的腦部神經炎癥，腦炎癥因子可能穿過血腦屏障引發外周炎癥。TGF-β1是TGF-β的一種亞單位，是由活化的T細胞和單核-巨噬細胞產生的細胞因子。研究〔21〕發現預先腦室內注射外源性TGF-β1，能夠預防海馬注射 Aβ1～42誘導的 AD認知功能損害，可能與TGF-β1能夠抑制膠質細胞和T細胞介導的神經炎性反應有關。

本研究表明，電針能夠調節中樞和外周抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1與促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的失衡狀態，且炎性因子在中樞和外周的變化趨勢基本一致。提示AD的腦內炎性物質和外周炎性物質相互作用，雖然有血腦屏障存在，但是這一類炎性小分子可能很容易穿過血腦屏障，至于哪一方占主導因素，根據當前的實驗結果尚不足以闡明。

中醫認為“正氣存內、邪不可干”，從某種角度看，慢性炎癥似乎相當于人體邪正斗爭的相持狀態，當人體正氣充足時，Aβ被清除能力增強，抗炎保護效應占優勢，則抗炎因子水平升高；當人體正氣不足時，Aβ清除減少，促炎破壞效應占優勢，則促炎因子水平升高。炎癥失衡相當于AD將病而未病的狀態，中醫講究治病必求于本，因此，延緩AD病程的關鍵在于提高患者的正氣。最近的研究逐步轉向固有免疫(先天免疫)紊亂導致膠質細胞清除Aβ障礙，而不再單純局限于從神經炎癥的角度來考察AD，把對AD的認識提高到一個較宏觀的視角，與中醫的整體觀念有異曲同工之妙。 綜上，AD大鼠腦內存在慢性神經炎性反應，在外周也伴隨著慢性炎性反應的進展，電針能夠有效改善AD癥狀，可能與改善抗炎/促炎的失衡狀態有關。由于AD神經炎癥與多種炎性細胞因子相關，因此，闡明各炎癥因子的作用及抗炎因子與促炎因子的相互關系也是進一步研究的方向。