松果菊苷對(duì)大鼠Leydig細(xì)胞衰老模型AXL和wnt2b基因的影響

孫靜 龐云瑞 單博穎 薛亞然 牛嗣云 鄭立雙 郗昕

(1河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，河北 保定 071000；2保定市第一醫(yī)院藥學(xué)部;3河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

根據(jù)甲基化芯片篩查結(jié)果〔1〕，從中選出甲基化基因AXL和wnt2b，通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)qRT-PCR、甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)技術(shù)，證明了肉蓯蓉能夠調(diào)控睪丸組織AXL和wnt2b基因的表達(dá)。本研究擬探討松果菊苷對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞衰老模型AXL和wnt2b基因的影響。

1 材料和方法

1.1睪丸間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和純度鑒定 取用2周齡Wistar雄性大鼠幼崽，無(wú)菌取出雙側(cè)睪丸組織，浸泡于預(yù)冷的PBS中。剝離睪丸組織中白膜，分離得到新鮮、結(jié)構(gòu)完整的睪丸組織。無(wú)菌膠原酶Ⅰ消化后，差異貼壁法分離、培養(yǎng)Leydig細(xì)胞。

1.2Leydig細(xì)胞衰老模型建立與鑒定 依據(jù)“自由基氧化損傷”理論〔2〕建立間質(zhì)細(xì)胞衰老模型，將新鮮配制的過(guò)氧化氫(H2O2)和FeSO4加入已培養(yǎng)2 d的細(xì)胞中，使?jié)舛确謩e為50 μmol/L和100 μmol/L，作用時(shí)間分別為8 h(即各加入的體積為2 μl)，成功建立了細(xì)胞衰老模型，并用 β-半乳糖苷酶染色成功鑒定細(xì)胞衰老狀態(tài)〔3〕。

1.3噻唑鹽(MTT)比色法篩選松果菊苷作用最適濃度 在培養(yǎng)2 d的細(xì)胞中加入不同濃度的松果菊苷進(jìn)行藥物處理，濃度梯度設(shè)置為10、20、40、80、160和320 μmol/L，持續(xù)作用1、2、3 d，上機(jī)檢測(cè)后計(jì)算細(xì)胞增殖活力，選擇最佳作用于Leydig細(xì)胞的濃度。

1.4細(xì)胞分組 正常組(培養(yǎng)128 h)，衰老組(氧化損傷8 h，繼續(xù)培養(yǎng)72 h)和松果菊苷組(氧化損傷8 h，松果菊苷用藥繼續(xù)培養(yǎng)72 h)。

1.5qRT-PCR TRIzol法提取Leydig 細(xì)胞總RNA，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水為對(duì)照孔，每孔加入2 μl，設(shè)置復(fù)孔，用酶標(biāo)儀進(jìn)行核酸定量RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。三組Leydig細(xì)胞的內(nèi)參均選擇β-actin ，熒光染料(SYBR)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。借助統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0，采用 2-△△ct計(jì)算方法統(tǒng)計(jì)分析三組的Ct值。引物序列：內(nèi)參β-actin上游引物:CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物:TTTAATGTCACGCACGATTTC；AXLF上游引物:GGTGGCTGTGAAGACGATG，下游引物:CTCAGATACTCCATGCCACT；wnt2b上游引物:GCTGGACCAAACCTGAACG，下游引物:CAAGAAGTATCGGGAAGCA。

1.6MSP 根據(jù)細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒，提取各組Leydig細(xì)胞DNA，核酸定量DNA濃度，一步法完成DNA樣本變性和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增甲基化基因AXL和wnt2b。3 % 瓊脂糖凝膠電泳，借助ChampGel 5000系統(tǒng)自帶Lane1軟件，統(tǒng)計(jì)分析三組甲基化百分比。引物序列：wnt2b甲基化上游引物：GGGAAAGTAGTTTAGTTGTTTTTG，甲基化下游引物:AAACTCCTTTAACCACACTACCCTC；wnt2b未甲基化上游引物:CGAGGTGGCAAACATCCTATATTAAG，未甲基化下游引物:CTTTGAAGGCTCCACTCCTGCACACT；AXL甲基化上游引物:AAGTATAAGAGTTTTAACTTAAGGTGGG，甲基化下游引物:ACTTACGCTACACCGTACAAAAA；AXL未甲基化上游引物:GGTGGCTGTGAGTTAGTTGAGACGATG，未甲基化下游引物:CCAAACTCAGATACTCCATGTTCTTCC。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MTT 篩選松果菊苷作用濃度結(jié)果 當(dāng)松果菊苷濃度達(dá)到 80 μmol/L，無(wú)論作用24 h 或 48 h，細(xì)胞活力開(kāi)始下降，320 μmol/L時(shí)下降最明顯；松果菊苷作用 72 h 后，不同濃度間細(xì)胞活力無(wú)差異，其中相同作用濃度，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，72 h時(shí)細(xì)胞活力最好(P<0.05)。綜合而言，72 h時(shí)細(xì)胞作用濃度為 20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活力最佳。見(jiàn)表1。

表1 Leydig 細(xì)胞的增殖活力

與320 μmol/L比較，1)P<0.05，與160 μmol/L比較：2)P<0.05；與80 μmol/L比較：3)P<0.05

2.2松果菊苷對(duì)衰老Leydig細(xì)胞AXL基因的影響 衰老組Leydig細(xì)胞 AXL mRNA 的表達(dá)水平顯著高于正常組，但甲基化水平明顯低于正常組(P<0.05)。松果菊苷用藥后AXL mRNA 表達(dá)水平明顯低于衰老組(P<0.05)，但AXL 的甲基化水平與衰老組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

2.3松果菊苷對(duì)衰老Leydig細(xì)胞wnt2b基因的影響 衰老組Leydig細(xì)胞 wnt2b mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，甲基化水平顯著低于正常組(P<0.05)。松果菊苷組用藥后wnt2b甲基化水平明顯升高(P<0.05)，但與衰老組Leydig細(xì)胞相比，二者wnt2b mRNA 表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表2 三組 AXL mRNA 的表達(dá)量

與衰老組比較：1)P<0.05，下表同

NG：正常組 AG：衰老組 SGJG：松果菊苷組 nc：陰性對(duì)照 M：甲基化 U：未甲基化，圖2同圖1 不同組AXL基因DNA甲基化水平變化

組別mRNA表達(dá)水平甲基化百分比(%)正常組0.081±0.0611)0.533±0.0241)衰老組1.000±0.0220.432±0.020松果菊苷組0.870±0.0780.494±0.0101)F值20.45131.449P值0.0000.000

圖2 不同組wnt2b基因DNA甲基化水平變化

3 討 論

H2O2是一種性質(zhì)穩(wěn)定易于獲得的強(qiáng)活性氧，常用于短期內(nèi)氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老〔2,3〕。de Silva等〔4〕用HaCaT 細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，HaCaT錨定阻滯會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷，從而引起了全基因組低甲基化趨勢(shì)，表明氧化應(yīng)激改變DNA甲基化從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。Wang等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠通過(guò)飲用水口服Cr(vi)不僅會(huì)引起血漿氧化應(yīng)激，而且會(huì)導(dǎo)致雄性大鼠血細(xì)胞的總體DNA低甲基化，并且在丙二醛(MDA)水平升高和總體DNA甲基化降低之間存在良好的相關(guān)性。目前，細(xì)胞衰老后的一些生物學(xué)特征，如形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，衰老有關(guān)的β-半乳糖苷酶表達(dá)，細(xì)胞周期停滯在G1期等已經(jīng)得到較好的闡述〔6〕。然而氧化損傷誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入永久停滯狀態(tài)的內(nèi)在甲基化機(jī)制尚不清楚。因此，更好地理解老化過(guò)程中氧化應(yīng)激和表觀遺傳相互作用，是確定老化過(guò)程關(guān)鍵基因改變的重要研究機(jī)制之一，對(duì)確定有效治療衰老的藥物，在衰老期間改善人類(lèi)健康及衰老和老年病的研究意義重大。

表觀遺傳學(xué)逐漸吸引了越來(lái)越多的興趣，因?yàn)樗呀?jīng)證明了在不修飾基因序列的情況下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力，可以積極地影響炎癥和癌癥疾病以及神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和發(fā)展過(guò)程〔7〕。老化時(shí)總的基因組DNA隨機(jī)發(fā)生低甲基化。轉(zhuǎn)座因子的DNA序列正常狀態(tài)時(shí)沉默，DNA甲基化喪失時(shí)則可被激活。在不同的年齡段，一些甲基化的改變可以定向發(fā)生于基因組的特定區(qū)域〔8〕。老化過(guò)程中DNA甲基化的部分改變并非是隨機(jī)發(fā)生的，大多與重復(fù)的DNA序列的CpG低甲基化有關(guān)〔8,10〕。Leydig細(xì)胞可能隨著細(xì)胞的衰老，逐漸喪失睪酮合成能力〔11〕。進(jìn)而推測(cè)Leydig 細(xì)胞的衰老狀態(tài)，可能對(duì)男性的生殖功能有影響。

AXL 是受體酪氨酸激酶家族 TAM 受體中(Tyro3，AXL 和 MER)成員之一〔3〕。睪酮替代療法(TRT)部分地通過(guò)增強(qiáng)Gas6表達(dá)來(lái)減輕細(xì)胞凋亡。此外，AXL的缺失使睪酮失效，這表明AXL是睪酮的重要下游調(diào)節(jié)劑。TRT將通過(guò)Gas6/ AXL信號(hào)通路改善與衰老相關(guān)的組織重塑，暗示其治療老化相關(guān)疾病的治療潛力〔12〕。本研究說(shuō)明松果菊苷可以通過(guò)抑制衰老的 Leydig 細(xì)胞中 AXL mRNA 表達(dá)水平，緩解 Leydig 細(xì)胞的衰老狀態(tài)。

wnt蛋白是一個(gè)分泌蛋白家族，調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的許多方面〔13〕。wnt/β-catenin信號(hào)通路控制著發(fā)育和成人生活中的各種生物學(xué)現(xiàn)象〔14〕。睪丸中wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)特異性促進(jìn)SSC和祖細(xì)胞的增殖〔15〕。也有研究表示wnt2b在附睪頭部高度表達(dá)，但在尾部幾乎不存在〔16〕。wnt信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞等多能性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)至關(guān)重要。盡管如此，wnt信號(hào)傳導(dǎo)與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之間的聯(lián)系至今尚未闡明。有研究表明wnt信號(hào)作為參與表觀遺傳變化的關(guān)鍵參與者的新作用，該信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以保護(hù)沉默基因組區(qū)域，并能維持基因組的穩(wěn)定性〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，wnt信號(hào)傳導(dǎo)參與睪丸減數(shù)分裂前未分化精原細(xì)胞的擴(kuò)增〔18〕。wnt2b的過(guò)表達(dá)即可導(dǎo)致組織畸形生長(zhǎng)，這主要是通過(guò)抑制細(xì)胞的周期和分化實(shí)現(xiàn)的〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn)了松果菊苷可以通過(guò)提高wnt2b甲基化水平，改變Leydig細(xì)胞的衰老狀態(tài)。